第一次做流式，最崩潰的不是上機(jī)，是上完機(jī)拿到那堆密密麻麻的散點圖。細(xì)胞碎片、死細(xì)胞、粘連體混在一起，根本分不清。導(dǎo)師丟下一句「你回去圈個門」，我對著屏幕愣了半天 —— 門在哪兒？

后來被師兄按著頭畫了十幾管樣本，才終于搞明白：圈門不是藝術(shù)創(chuàng)作，是一套固定到有點死板的排除邏輯。順序?qū)α?，誰畫都一樣。

今天就用人外周血分 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞的真實流程，把每一步在電腦上怎么點、畫什么形狀、排除什么，完完整整走一遍。新手直接照著做就行：

先別急著畫門，看懂兩張圖

流式所有圈門，第一步全都要看 FSC 和 SSC。不用背原理，記住兩句話：

FSC：只看細(xì)胞大小，細(xì)胞個頭越大，數(shù)值越高；

SSC：只看細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)部越復(fù)雜（顆粒多），數(shù)值越高。

例如：正常人外周血白細(xì)胞，在 FSC/SSC 散點圖上自然分成三堆，位置非常固定：

• 左下角：淋巴細(xì)胞（個頭小、結(jié)構(gòu)簡單）

• 中間偏上：單核細(xì)胞（個頭中等、結(jié)構(gòu)中等）

• 右上角：粒細(xì)胞（個頭最大、顆粒最多）

圖 1：外周血三群典型位置，記牢這個圖，后面所有操作都從這里出發(fā)

（源自騰訊網(wǎng)視頻）

做好對照，圈門才不會瞎畫

很多人結(jié)果不準(zhǔn)、重復(fù)性差，不是因為不會畫門，而是沒調(diào)對照就上樣本。這三類對照，上機(jī)前必須調(diào)好，不然你圈出來的群可能是假的：

空白對照（未染色細(xì)胞）：定出陰性基線，分清「真信號」和「背景噪音」

同型對照：排除抗體非特異性結(jié)合，避免假陽性

單染管對照：調(diào)熒光補(bǔ)償，解決光譜重疊串色

圖 2：對照調(diào)好的樣子，陰性和陽性分得清清楚楚

（源于畢合生物）

六步圈門流程：在電腦上一步一步點出來

• 案例：人外周血，裂紅后染色（CD3-FITC 標(biāo)記 T 細(xì)胞，CD19-APC 標(biāo)記 B 細(xì)胞，7-AAD 死活染料）。
  

• 目標(biāo)：統(tǒng)計樣本中 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞的真實占比。

圖 3. 源自 BD Biosciences

第 1 步：先篩出完整、有效的細(xì)胞，剔除所有碎片

調(diào)取散點圖：FSC-A vs SSC-A。直接手動畫一個大多邊形門，把中間形態(tài)完整、輪廓正常的完整細(xì)胞全部圈進(jìn)去。左下角零散、信號又弱又碎的小點，全是細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，直接排除，不要圈入門內(nèi)。

圖 4：源自丁香園

第 2 步：去掉細(xì)胞粘連體（連體嬰）

調(diào)取散點圖：FSC-H vs FSC-A，只針對第一步圈好的細(xì)胞群單獨分析。正常單個細(xì)胞，信號面積和信號高度比例均勻，會整齊沿著對角線排布。兩個或多個細(xì)胞粘在一起的粘連體，會明顯偏離對角線。直接畫橢圓門圈住對角線整齊細(xì)胞群，門外全部粘連雜體直接剔除。

圖 5：源自菲恩生物

圖 6：源自賽爾普生物

第 3 步：精準(zhǔn)篩出活細(xì)胞

調(diào)取散點圖：SSC-A vs 7-AAD 死活染料，僅對上一步合格單細(xì)胞分析。死細(xì)胞細(xì)胞膜破損，7-AAD 染料能鉆進(jìn)細(xì)胞結(jié)合核酸，熒光信號會特別強(qiáng)；活細(xì)胞不會結(jié)合染料，熒光完全陰性。直接圈出 7-AAD 陰性細(xì)胞群，留下來的是高活性合格細(xì)胞。

圖 7：活細(xì)胞在陰性區(qū)，死細(xì)胞跑到右邊去了

（源自 Cell Signaling）

第 4 步（可選，但樣本雜質(zhì)多時必做）：純化免疫細(xì)胞

調(diào)取散點圖 SSC-A vs CD45（白細(xì)胞通用標(biāo)記）。直接圈出 CD45 陽性細(xì)胞群，把殘留的少量紅細(xì)胞、破碎雜質(zhì)、非白細(xì)胞全部篩掉，后續(xù)分群背景會更干凈，數(shù)據(jù)更穩(wěn)。

圖 8：CD45 陽性門內(nèi)才是真正的白細(xì)胞

（源自廈泰生物）

如果你的樣本雜質(zhì)多、背景臟，這一步能讓你后面的分群干凈一大截。

第 5 步：核心熒光分群，精準(zhǔn)區(qū)分 T 細(xì)胞 vs B 細(xì)胞

調(diào)取散點圖：CD3-FITC vs CD19-APC，只在前面篩選好的活細(xì)胞里分析，直接用經(jīng)典四象限門劃分亞群：

左上象限：CD3 陽性、CD19 陰性 —— 功能性 T 細(xì)胞。

右下象限：CD3 陰性、CD19 陽性 —— 功能性 B 細(xì)胞。

左下象限：雙陰性細(xì)胞，主要是單核細(xì)胞、NK 細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞。

右上象限：雙陽性細(xì)胞，正常外周血里數(shù)量極少，基本可以忽略

圖 9：源自知乎

看到 T、B 清清楚楚分開在四個象限里，前面所有臟活累活就都值了。

第 6 步：導(dǎo)出數(shù)據(jù)，收工

圈門全部確認(rèn)無誤后，直接讀取門內(nèi)細(xì)胞占比，就能得到真實可用的實驗數(shù)據(jù)，這樣數(shù)據(jù)干凈、重復(fù)性高，后續(xù)復(fù)測誤差也很小。

圖 10：圈門確認(rèn)無誤后直接讀比例

（源自于 Elanscience）

重復(fù)實驗小技巧：保存好門的位置，下次直接調(diào)用，不要憑感覺重新畫，否則誤差很大。

三條不廢話的實操原則（血淚總結(jié)）

1. 順序不能亂

碎片 → 單細(xì)胞 → 活細(xì)胞 → 亞群
每一步只在上一步合格的門內(nèi)操作，不可逆、不許跳步。

2. 不看對照不畫門

基線、補(bǔ)償全部用對照管調(diào)好。門畫在陰性邊界上，不要憑肉眼主觀往右挪。挪一次，數(shù)據(jù)就不敢信了。

3. 門形跟著細(xì)胞群輪廓走

常規(guī)免疫細(xì)胞用多邊形或橢圓門，貼合細(xì)胞群邊緣。遇到稀有細(xì)胞或弱表達(dá)，切換密度圖或等高線圖，邊界看得更清楚，圈得更準(zhǔn)。

這套思路還能用在哪？

你學(xué)會了上面這套分層排除法，不只是 T、B 細(xì)胞，絕大多數(shù)流式實驗都能直接套用：

• 免疫分型：CD4 / CD8 T 細(xì)胞亞群、Th1/Th2、單核細(xì)胞分群（CD14、CD16）

• 細(xì)胞凋亡：Annexin V / PI 雙染，區(qū)分活、早期凋亡、晚期凋亡、壞死

• 細(xì)胞周期：PI 染色，圈 G0/G1、S、G2/M

通用公式：圈出主細(xì)胞群 → 圈出單細(xì)胞 → 圈出活細(xì)胞 → 用特異標(biāo)記圈出目標(biāo)細(xì)胞

圖 11：整個圈門邏輯的總結(jié)圖，看一眼就記住

（源自知乎）

第一次畫門，你可能還是會手忙腳亂。沒關(guān)系，照著上面的六步，一步一個圖，畫完一遍之后，你會發(fā)現(xiàn)：

• 那些雜亂無章的散點圖，其實一直都有規(guī)律。

• 保存好你的門模板，下次做重復(fù)實驗，直接調(diào)用。

這樣出來的數(shù)據(jù)，你自己敢信，審稿人也挑不出毛病。

編輯：冷漠小 z

題圖：自制