圈門就是在散點圖上一步步劃定你感興趣的區(qū)域，從成千上萬個細胞中把目標群體「篩」出來。但要注意，圈門策略沒有萬能模板 —— 它完全取決于你的樣本類型和實驗目的。

今天，小編帶大家看一下國際流式學會（ISAC）旗下的 Cytometry Part A 期刊中的 OMIP 專欄（Optimized Multicolor Immunofluorescence Panels），里面收錄了上百套經(jīng)過同行評議、可以直接拿來用的多色流式檢測方案。其中，OMIP-001 作為開篇之作，教大家學會「如何系統(tǒng)分析人外周血中 T 細胞的分化狀態(tài)和功能活性」。

今天我們就以 OMIP-001 為主線，再配合一些其他有代表性的圖例，一步步拆解免疫細胞圈門的基本思路。

圖 1 源自： OMIP-001

第一步：去粘連 —— 確保每個被計數(shù)的細胞都獨立通過

在獲取血液或細胞懸液樣本時，細胞與細胞之間常常會發(fā)生粘連，形成「雙聯(lián)體」甚至「多聯(lián)體」。如果這些粘連體被當作單個細胞進行分析，的計數(shù)將嚴重失準，功能分析也會受到極大干擾。

圖 2 源自：優(yōu)寧維官網(wǎng)

當你拿到一份血液或細胞懸液樣本時，細胞之間常常會粘在一起，形成「雙聯(lián)體」甚至「多聯(lián)體」。如果把這些「抱團」的細胞當成單個細胞來分析，細胞數(shù)量就會嚴重失真，后續(xù)的功能分析也跟著跑偏。

那么怎么把粘連體去掉呢？OMIP-001 方案在分析的第一關就做了「去粘連」處理。用 FSC-A（前向散射光脈沖面積）和 FSC-W 或 FSC-H（前向散射光脈沖寬度或高度）這兩個參數(shù)來比對。

原理其實不復雜：單個細胞通過激光束時，信號的面積和高度大致成正比；而兩個細胞粘在一起通過時，面積會明顯變大，但高度變化不大 —— 兩者的比例就會出現(xiàn)異常。你只需要在散點圖上圈出「面積 ≈ 高度」那個線性區(qū)域里的細胞，就能有效排除雙聯(lián)體。此外：不同型號的流式細胞儀可能用不同的參數(shù)組合（比如 FSC-W/FSC-A 或 FSC-H/FSC-A）。如果你做細胞周期實驗，用 A 和 W 的組合去粘連會更徹底。

圖 3 源自：優(yōu)寧維官網(wǎng)

第二步：排除死細胞

活細胞與死細胞之間一個關鍵的區(qū)別在于細胞膜的完整性?；罴毎毎ね暾?，熒光染料無法自由進入，染色信號清晰可控；而死細胞的細胞膜發(fā)生破損，各種抗體和染料會非特異性結合到胞內(nèi)組分上，產(chǎn)生大量虛假的陽性信號。

圖 4 源自：小桔網(wǎng)

OMIP-001 方案中采用了胺反應型死活染料 VIVID 來識別死細胞?；罴毎募毎ね旰茫玖喜荒苓M入，信號維持低水平；死細胞膜破損，染料自由滲入并與胞內(nèi)蛋白質發(fā)生共價結合，熒光信號陡升。研究者將 VIVID 的熒光信號繪制成直方圖，圈出低熒光區(qū)域（即活細胞區(qū)域），這樣就從源頭上將有問題的死細胞排除在外。

OMIP-001 在排除死細胞的同時，將 CD14 和 CD19 納入同一個「排除通道」——CD14 標記單核細胞和巨噬細胞，CD19 標記 B 細胞 —— 這樣在第一步去粘連之后，通過一次操作就完成了「活細胞+去除單核/B 細胞 」的雙重篩選，高效且簡潔。

圖 5 源自：OMIP-001

第三步：從淋巴細胞門到 T 細胞

在活細胞群體中，不同類型的細胞在大小（FSC）和內(nèi)部顆粒復雜度（SSC）方面差異顯著。根據(jù) FSC 和 SSC 兩個物理參數(shù)，可以初步區(qū)分淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。FSC 越高代表細胞越大，SSC 越高代表胞內(nèi)顆粒結構（如溶酶體、分泌囊泡等）越豐富。（標本在 FSC/SSC 散點圖可將淋巴細胞群（R1，紅色）、單核細胞群（R2，綠色）、粒細胞群（R3，紫色）、非白細胞群（R4，藍色）清晰地區(qū)分開。

圖 6 源自：流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群指南

根據(jù)淋巴細胞的發(fā)生來源、形態(tài)結構、表面標志物及免疫功能不同，淋巴細胞可分為 T 細胞(CD3+)、B 細胞 (CD3-CD19+) 和 NK 細胞 (CD3-CD16+CD56+) 等細胞群，此外，根據(jù) CD4 和 CD8 的表達不同，T 細胞又分為 2 個亞群：輔助性 T 細胞 (CD3+CD4+) 和殺傷性 T 細胞 (CD3+CD8+)。

圖 7 源自：知乎網(wǎng)

如果你在同一個實驗中希望同時分析淋巴細胞中所有的免疫細胞亞群，可以從淋巴細胞門先分 CD3+T 細胞。而也有先圈出 CD45+的總白細胞，再逐步分選 T 細胞、B 細胞、NK 細胞、單核細胞、樹突狀細胞等各類免疫細胞亞群，從而構建一個完整的全白細胞圖譜?？傊煌桨阜沼诓煌难芯磕繕?，圈門邏輯也隨之調(diào)整。

圖 8 源自：https://www.iivd.net/thread-79634-1-1.html

第四步：功能評估與記憶/分化亞群分析

OMIP-001 之所以被稱為 OMIP 系列的「開篇經(jīng)典」，是因為它不只停留在 T 細胞的「身份鑒定」，在確定了 CD4+和 CD8+T 細胞后，還進一步回答了「這些 T 細胞到底能干什么」這個深層問題 ——也就是「功能性免疫學」的核心命題。

圖 9 源自：優(yōu)寧維官網(wǎng)

（1）功能評估：在確定了 CD4+和 CD8+T 細胞后，進一步檢測三種關鍵細胞因子的分泌情況：如 IFN-γ（干擾素-γ，反映 T 細胞的殺傷性潛能）、TNF-α（腫瘤壞死因子-α，反映炎癥效應能力）和 IL-X（白介素-X，反映 T 細胞的增殖和分化）。

圖 10 源自：小桔網(wǎng)

OMIP-001 的策略是：利用 FlowJo 軟件中的 Boolean gate（布爾邏輯門）功能，將所有分泌任意一種細胞因子的 T 細胞定義為「功能性陽性群體」（cyt+），獲得一個針對「T 細胞真實功能」的總體畫像。這種「表型+功能」的雙層分析邏輯 ——先整體評估 CD4+和 CD8+ T 細胞的因子分泌能力，再綜合評估各個亞群的功能狀態(tài)。

圖 11 源自：OMIP-001

（2）記憶與分化：將功能性陽性細胞映射回表面標志物的表達組合后，下一步需要確認：這些能分泌細胞因子的 T 細胞，到底處于分化路途上的哪個階段？

OMIP-001 采用 CD45RO 和 CCR7 的組合，將 CD4+和 CD8+ T 細胞進一步區(qū)分為：初始 T 細胞（CD45RO-CCR7+）、中央記憶 T 細胞（CD45RO+CCR7+）、效應記憶 T 細胞（CD45RO+CCR7-）以及終末分化效應記憶 T 細胞（TEMRA，CD45RO-CCR7-）。同時，方案中還整合了 CD27、CD57、PD-1 等標志物，用以辨別記憶細胞是否保留共刺激/增殖潛能（CD27+），是否存在衰老/耗竭狀態(tài)（CD57+PD-1^low / PD-1^high），以及是否仍保有長期存活與再激活能力（CD127/CD28）。

CD45RA/CCR7 四象限分型已經(jīng)成為 T 細胞分化免疫學評價領域的基本工具。

圖 12 源自：OMIP-001

最后提供一個實例應用：小鼠全血白細胞分化全套設門方案

如果你不滿足于僅僅分析 T 細胞，而是希望全面分析小鼠血液中的全部白細胞亞群，那么 2024 年發(fā)表在 Cells 期刊上的一篇研究可以為你提供一個完整的技術模板。該研究由德國的 Elise Arlt 等人主導，在 C57BL/6J 小鼠中建立了一套從樣本處理、抗體染色到全套圈門策略的標準化方法。（文章提供了免疫細胞中多種亞群的圈門策略，具體可以參考文獻中的圖例）

其圈門流程分為以下關鍵步驟：

第一步：排除碎片：利用 FSC 和 SSC 散點圖，將紅細胞、血小板和細胞碎片排除在外（這類組分通常聚集在左下角）；

第二步：排除死細胞：采用碘化丙啶（PI）標記并排除死細胞；

第三步：圈出白細胞：利用 CD45 這一白細胞泛標志物，篩選出 CD45+的完整白細胞群體；

第四步：各亞群分型：在上述 CD45+白細胞的基礎上，利用各種特異標志物進一步圈出 T 細胞（CD3+）、B 細胞（CD19+）、NK 細胞（NK1.1+）、單核細胞、粒細胞、樹突狀細胞及肥大細胞等多種細胞亞群，并成功完成了老齡/幼齡以及雄/雌小鼠的白細胞分化計數(shù)比較。

圖 14 PMID: 39329764

此外，該研究在去死細胞和去粘連之前，還額外增加了「去雙聯(lián)體」步驟—— 先用 FSC-A/FSC-H 兩個參數(shù)排除雙聯(lián)體和多聯(lián)體，再用 SSC-W/SSC-H 進一步排除黏連事件，從而最大限度地確保了數(shù)據(jù)準確性。

需要注意的是，圈門策略并沒有一個「萬能模板」。采用哪種策略，完全取決于你的實驗設計、樣本性質以及你打算回答何種科學問題。

圈門遇到拿不準的？可以進群和學霸菌一起討論，識別下方圖片，回復「流式」，進來一起「云實驗」！

編輯：冷漠小 z

題圖：自制