做 Annexin V/PI 雙染，最怕的不是「染不上」，而是圖看起來(lái)很像那么回事，結(jié)論卻站不住。

對(duì)照組凋亡率偏高、象限邊界怎么畫(huà)都別扭、同一批細(xì)胞重復(fù)性忽高忽低、審稿人追問(wèn)「這到底是不是凋亡」…… 這些問(wèn)題，很多時(shí)候并不是流式儀「不給力」，而是從樣本處理、對(duì)照設(shè)置到圈門(mén)邏輯，一開(kāi)始就埋了坑。

今天我們就把流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡中最常見(jiàn)、也最容易被忽視的幾個(gè)誤區(qū)捋一遍。建議收藏，上機(jī)前對(duì)照檢查一遍，能少走很多彎路。

先把原理捋順：Annexin V/PI 到底在看什么？

細(xì)胞凋亡早期，一個(gè)很典型的變化是細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）外翻到膜外側(cè)。

Annexin V 是一種鈣離子依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白，可以和外翻的 PS 結(jié)合，因此常用于標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞。PI（碘化丙啶）則是一種膜不通透的核酸染料，正常活細(xì)胞進(jìn)不去；只有當(dāng)細(xì)胞膜完整性受損時(shí)，PI 才能進(jìn)入細(xì)胞并和核酸結(jié)合。

圖 1. Annexin V 結(jié)合外翻 PS 的原理示意。圖片來(lái)源：聯(lián)科生物

所以在經(jīng)典 Annexin V/PI 四象限圖里，通?？梢赃@樣理解：

左下象限：Annexin V-/PI-，多為活細(xì)胞。

右下象限：Annexin V+/PI-，多為早期凋亡細(xì)胞。

右上象限：Annexin V+/PI+，多為晚期凋亡或繼發(fā)性壞死細(xì)胞。

左上象限：Annexin V-/PI+，常見(jiàn)于機(jī)械損傷、膜破裂或非典型死亡細(xì)胞。

圖 2. Annexin V/PI 四象限判讀示意。圖片來(lái)源：百度

但注意，這只是「常規(guī)判讀框架」，真正決定數(shù)據(jù)可信度的，往往是下面這些細(xì)節(jié)。

誤區(qū)一：Annexin V 陽(yáng)性，就等于細(xì)胞凋亡

很多同學(xué)看到 Annexin V 陽(yáng)性升高，就直接寫(xiě)「細(xì)胞凋亡增加」。這個(gè)結(jié)論在常規(guī)藥物誘導(dǎo)模型中可能成立，但嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，Annexin V 陽(yáng)性只能說(shuō)明 PS 暴露增加，不能單獨(dú)證明細(xì)胞一定發(fā)生了典型凋亡。

PS 外翻并非凋亡獨(dú)有。細(xì)胞消化過(guò)度、劇烈吹打、離心條件過(guò)強(qiáng)、細(xì)胞膜受到機(jī)械損傷時(shí)，也可能出現(xiàn) Annexin V 陽(yáng)性。某些細(xì)胞活化狀態(tài)、其他形式的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，也可能伴隨 PS 暴露或膜完整性變化。

換句話(huà)說(shuō)，Annexin V/PI 更適合回答「這批細(xì)胞的膜狀態(tài)和凋亡相關(guān)表型是否發(fā)生變化」，而不是單獨(dú)完成「死亡方式定性」。

更穩(wěn)妥的做法是：如果你更關(guān)注「凋亡機(jī)制」，建議聯(lián)合檢測(cè)活化 Caspase-3、Caspase-3/7 活性、PARP 裂解、線粒體膜電位，或結(jié)合顯微形態(tài)學(xué)結(jié)果。尤其是要區(qū)分凋亡、焦亡、鐵死亡、壞死時(shí)，單靠 Annexin V/PI 很容易說(shuō)不清。

圖 3. 活細(xì)胞 Caspase-3/7 活性與 Annexin V 雙重檢測(cè)示例。圖片來(lái)源：aladdin 官網(wǎng)

誤區(qū)二：樣本處理差一點(diǎn)，問(wèn)題不大

很多「對(duì)照組凋亡率異常偏高」的問(wèn)題，并不是處理因素真的誘導(dǎo)了凋亡，而是細(xì)胞在收樣、消化、離心、重懸過(guò)程中被人為傷到了。

常見(jiàn)雷區(qū)包括：

• 胰酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞被過(guò)度刺激；

• 反復(fù)劇烈吹打，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損；

• 離心力過(guò)高或離心次數(shù)過(guò)多，脆弱細(xì)胞被進(jìn)一步損傷；

• 收樣時(shí)丟掉培養(yǎng)上清，只收貼壁細(xì)胞，導(dǎo)致已脫落的凋亡細(xì)胞被漏掉；

• 用普通 PBS 重懸 Annexin V 染色體系，忽略了 Annexin V 與 PS 結(jié)合需要 Ca2+。

比較穩(wěn)妥的流程是：貼壁細(xì)胞輕柔消化，合并培養(yǎng)上清中的漂浮細(xì)胞；低速離心，比如 300 × g、5 min 左右；盡量減少洗滌次數(shù)；用配套的 1× Annexin V Binding Buffer 重懸；染色后避光，盡快上機(jī)。

圖 4. Annexin V/PI 四象限各區(qū)域含義示意。圖片來(lái)源：東極生物官網(wǎng)

這里尤其要提醒一點(diǎn)：Annexin V 染色體系不要隨手換緩沖液。EDTA 或缺鈣環(huán)境會(huì)影響 Annexin V 與 PS 的結(jié)合，可能帶來(lái)假陰性；染色后長(zhǎng)時(shí)間放置，也可能讓細(xì)胞狀態(tài)繼續(xù)變化，導(dǎo)致結(jié)果偏移。

誤區(qū)三：一上來(lái)就看 Annexin V/PI 圖

四象限圖當(dāng)然重要，但它不是第一步。在進(jìn)入 Annexin V/PI 分析之前，建議先完成前置圈門(mén)。最基本的順序可以是：

第一步，看 FSC/SSC，排除明顯碎片和異常顆粒。

第二步，用 FSC-A/FSC-H 或 FSC-A/FSC-W 排除雙聯(lián)體和細(xì)胞團(tuán)。

第三步，再在單細(xì)胞群里看 Annexin V/PI。

如果前置門(mén)沒(méi)做好，碎片、細(xì)胞團(tuán)、死細(xì)胞殘片都可能混進(jìn)后面的四象限里。結(jié)果看上去是「凋亡比例升高」，實(shí)際上可能只是樣本質(zhì)量變差。

圖 5. FSC/SSC 前置圈門(mén)可幫助排除碎片和異常事件。圖片來(lái)源：Elabscience

對(duì)于狀態(tài)很差、碎片很多、細(xì)胞大小變化明顯的樣本，還可以增加 time gate，排除上機(jī)過(guò)程中堵針或流速不穩(wěn)的時(shí)間段。這個(gè)小步驟在多樣本比較時(shí)很有用。

圖 6. 樣本狀態(tài)散點(diǎn)圖示例，異常群體會(huì)影響后續(xù)凋亡判讀。圖片來(lái)源：上海中喬新舟生物科技有限公司

誤區(qū)四：四象限直接機(jī)械切十字

Annexin V/PI 圖里，細(xì)胞群常常不是整齊地分成四塊，而是從活細(xì)胞區(qū)向 Annexin V 陽(yáng)性區(qū)逐漸拖尾。凋亡本來(lái)就是連續(xù)動(dòng)態(tài)過(guò)程，硬用一個(gè)固定十字把所有樣本切開(kāi)，很容易把過(guò)渡群體算錯(cuò)。

正確做法不是「每張圖都畫(huà)到最好看」，而是先用未染色對(duì)照、單染對(duì)照和陰性對(duì)照建立邊界，再在同批樣本中保持同一套門(mén)控。

如果樣本呈現(xiàn)明顯拖尾，可以考慮用多邊形門(mén)、等高線圖或密度圖輔助判斷。關(guān)鍵不是門(mén)畫(huà)得多復(fù)雜，而是標(biāo)準(zhǔn)要清楚、可重復(fù)、能解釋。

另外，補(bǔ)償一定要用單染對(duì)照來(lái)調(diào)。Annexin V-FITC 和 PI、PE、7-AAD 等通道之間都可能有光譜溢出。補(bǔ)償沒(méi)調(diào)好時(shí)，假陽(yáng)性和象限漂移會(huì)非常明顯。

誤區(qū)五：只設(shè)空白對(duì)照就夠了

空白對(duì)照只能告訴你細(xì)胞自身散射和自發(fā)熒光的大概情況，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠支撐 Annexin V/PI 的完整分析。

建議至少準(zhǔn)備這些對(duì)照：

• 未染色對(duì)照：用于觀察自發(fā)熒光和初步調(diào)電壓；

• Annexin V 單染對(duì)照：用于補(bǔ)償和 Annexin V 陽(yáng)性邊界設(shè)置；

• PI 單染對(duì)照：用于補(bǔ)償和 PI 陽(yáng)性邊界設(shè)置；

• 陰性對(duì)照：健康或未處理細(xì)胞，用于判斷基礎(chǔ)死亡水平；

• 陽(yáng)性凋亡對(duì)照：如星形孢菌素、紫杉醇、H2O2 等誘導(dǎo)模型，驗(yàn)證體系能檢測(cè)到凋亡；

• 機(jī)械損傷對(duì)照：通過(guò)較強(qiáng)吹打或較高離心力模擬操作損傷，用于估計(jì)人為處理帶來(lái)的基線假陽(yáng)性；

• 實(shí)驗(yàn)組：正式分析不同處理?xiàng)l件下的凋亡變化。

圖 7. 未染、單染、雙染對(duì)照設(shè)置示例。圖片來(lái)源：聯(lián)科生物

如果要把數(shù)據(jù)寫(xiě)進(jìn)論文或項(xiàng)目報(bào)告，建議把「早期凋亡率」「晚期凋亡/死亡率」「總 Annexin V 陽(yáng)性比例」 分開(kāi)呈現(xiàn)，不要只給一個(gè)總百分比。這樣審稿人或讀者更容易判斷：變化到底發(fā)生在早期凋亡，還是細(xì)胞已經(jīng)大量進(jìn)入膜破裂階段。

最后還有兩個(gè)容易被忽略的小點(diǎn)

第一，凋亡是動(dòng)態(tài)過(guò)程，單一時(shí)間點(diǎn)可能剛好錯(cuò)過(guò)峰值。建議先做時(shí)間梯度，比如 6 h、12 h、24 h、48 h，再確定正式實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)窗口。

第二，不同細(xì)胞類(lèi)型耐受性差異很大。懸浮細(xì)胞、原代細(xì)胞、神經(jīng)元、肝細(xì)胞等往往更脆弱；腫瘤細(xì)胞株相對(duì)耐受，但也不能一概而論。換細(xì)胞系、換處理?xiàng)l件、換消化方式時(shí)，最好重新做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

上機(jī)前自查清單

發(fā)布實(shí)驗(yàn)結(jié)果前，可以用下面這份清單快速檢查：

• 是否合并了培養(yǎng)上清中的漂浮細(xì)胞？

• 是否避免了過(guò)度消化、劇烈吹打和高離心力？

• 是否使用含 Ca2+ 的 Annexin V Binding Buffer？

• 是否在染色后盡快上機(jī)，并保持避光？

• 是否先做 FSC/SSC、單細(xì)胞門(mén)，再看 Annexin V/PI？

• 是否有未染、單染、陰性、陽(yáng)性對(duì)照？

• 是否用單染對(duì)照完成補(bǔ)償？

• 是否把早期凋亡、晚期凋亡/死亡和總陽(yáng)性比例分開(kāi)報(bào)告？

Annexin V/PI 雙染是流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡中最常用、也最容易上手的方法。但不要只盯四象限；把樣本、對(duì)照、圈門(mén)和聯(lián)合驗(yàn)證做好，數(shù)據(jù)才經(jīng)得起追問(wèn)。