近日，天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院楊吉龍教授、天津醫(yī)科大學黃丹丹教授、天津醫(yī)科大學/廣州市婦女兒童醫(yī)療中心李俊教授及溫州醫(yī)科大學甌江實驗室王朝研究員鼎立合作，在國際期刊Advanced Science上在線發(fā)表題為Genome-Wide CRISPR Screen Identifies a microRNA OrchestratingPleiotropic Resistance to Targeted Therapy and T Cell Immunity in Melanoma的研究論文。該研究從全基因組水平系統(tǒng)性揭示了微小RNA（miRNA）在黑色素瘤“靶向-免疫”交叉耐藥中的關鍵調控作用，為克服復雜耐藥機制提供了全新視角和潛在治療策略。

黑色素瘤治療中的“交叉耐藥”困境

黑色素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例超過30萬，死亡病例約6萬。BRAF/MEK靶向治療和PD-1/CTLA-4免疫檢查點治療雖顯著改善了晚期患者的預后，但大量患者在治療過程中先后或同時對靶向藥物和免疫治療產(chǎn)生耐藥，形成所謂“交叉耐藥”。一線治療失敗的患者往往對后續(xù)方案的應答率大幅下降，導致不可逆的疾病進展。然而，驅動這一多重耐藥的上游分子機制，尤其是非編碼RNA在其中的角色，長期以來懸而未決。

全基因組篩選鎖定關鍵分子miR-18a

為系統(tǒng)解析miRNA在交叉耐藥中的作用，研究團隊自主構建了一款新型全基因組miRNA CRISPR敲除文庫。該文庫整合miRBase v21與FANTOM5數(shù)據(jù)庫中的2,185條miRNA，共設計8,598條sgRNA，在覆蓋廣度和靶向精度上均顯著優(yōu)于已有文庫。以BRAF V600E突變型黑色素瘤A375細胞為模型，團隊開展了兩套平行篩選：分別評估m(xù)iRNA缺失對BRAF抑制劑維莫非尼（VEM）的耐藥效應和對CD8? T細胞殺傷的耐受效應。兩套篩選的生物學重復性均較高（Spearman相關系數(shù)≥0.9）。正向選擇分析發(fā)現(xiàn)，miR-18a在兩套篩選中均顯著富集，是同時關聯(lián)靶向治療耐藥與免疫逃逸的關鍵候選分子。

后續(xù)驗證表明，在A375、SK-MEL-28以及鼠源YUMM1.7細胞系中，miR-18a敲除均賦予細胞對VEM、MEK抑制劑及ERK抑制劑的顯著耐藥性，同時削弱CD8? T細胞的殺傷效力；而重新引入miR-18a-5p或miR-18a-3p可大幅恢復藥物敏感性和免疫易感性，證實了miR-18a的核心調控地位。

臨床隊列證實miR-18a下調與治療耐藥及不良預后密切相關

為深入探究miR-18a下調與黑色素瘤靶向和免疫治療耐藥的關系，研究團隊首先構建了A375 VEM耐藥株（A375-VR）和耐CD8? T細胞殺傷株（A375-TR）。與親本株相比，兩種耐藥細胞中miR-18a的表達均顯著下調；而過表達miR-18a-mimic可顯著逆轉耐藥表型。

進一步，團隊整合了來自七個治療隊列的120對（61對靶向治療，59對免疫治療）黑色素瘤患者縱向RNA-seq和臨床數(shù)據(jù)。系統(tǒng)性分析表明，在BRAFi/MEKi靶向治療或抗PD-1/CTLA-4免疫治療期間，miR-18a活性降幅越大，治療應答越差、生存預后越不理想；miR-18a活性變化還與腫瘤浸潤CD8? T細胞比例呈顯著正相關。

揭示“一箭雙雕”的平行調控機制

轉錄組和單細胞測序分析提示，miR-18a缺失可能通過兩條平行信號通路分別介導兩種耐藥表型：一方面通過Hippo信號通路影響靶向藥物敏感性；另一方面通過TGF-β信號通路影響CD8? T細胞殺傷效應。

機制研究表明，miR-18a通過兩條平行的信號通路分別調控兩種耐藥表型：

1. 靶向治療耐藥——AJUBA/Hippo/YAP軸。 miR-18a-5p直接靶向Hippo通路負調控因子AJUBA。miR-18a缺失解除對AJUBA的抑制，導致LATS1/2激酶活性降低、YAP去磷酸化并核轉位，激活促存活基因CTGF和CYR61的轉錄，驅動BRAF抑制劑耐藥。裸鼠移植瘤模型中，miR-18a-5p mimics或YAP抑制劑（verteporfin、VT3989）聯(lián)合VEM可顯著抑制耐藥腫瘤生長。

2. 免疫耐受——THBS1/CD47軸。miR-18a-5p同時直接靶向THBS1。miR-18a缺失使腫瘤細胞高表達THBS1，后者與CD8? T細胞表面CD47結合，損害免疫突觸形成，削弱T細胞殺傷活性。在C57BL/6小鼠同基因移植瘤模型中，瘤內(nèi)注射miR-18a-5p mimics顯著抑制腫瘤生長；單細胞測序證實TGF-β信號減弱、Thbs1–Cd47通訊降低、CD8? T細胞浸潤增加。CD47阻斷抗體magrolimab同樣可逆轉miR-18a缺失引起的免疫逃逸。

綜上，miR-18a作為上游樞紐，將腫瘤內(nèi)在耐藥信號與免疫微環(huán)境重塑統(tǒng)一于同一調控框架之下，實現(xiàn)了“一箭雙雕”的平行調控。

上游調控因子的發(fā)現(xiàn)與臨床驗證

研究進一步發(fā)現(xiàn)，RNA結合蛋白 hnRNP A1 是miR-18a的關鍵上游調控因子，通過促進pre-miR-18a的加工成熟維持miR-18a水平。靶向藥物或T細胞殺傷的治療壓力下，hnRNP A1表達下調，導致miR-18a降低，從而啟動雙重耐藥通路。RIP實驗與正反向救援實驗一致支持“hnRNP A1→ miR-18a → AJUBA/THBS1”的單向調控級聯(lián)。

在臨床層面，在天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院 53例獨立驗證隊列中，組織芯片免疫組化與原位雜交證實hnRNP A1高表達與miR-18a高表達顯著相關（P = 6.1 × 10?13），為調控機制提供了臨床佐證。

新的聯(lián)合治療策略與展望

基于上述發(fā)現(xiàn)，團隊提出了針對多重耐藥的潛在干預策略：恢復腫瘤內(nèi)miR-18a表達，或聯(lián)合使用YAP–TEAD抑制劑（verteporfin、VT3989）和CD47阻斷抗體（magrolimab），有望同步逆轉靶向藥物耐藥與免疫逃逸。該研究首次在全基因組水平系統(tǒng)描繪了miRNA介導黑色素瘤交叉耐藥的分子框架，為開發(fā)新型聯(lián)合治療方案和預測性生物標志物奠定了基礎。

圖 miR-18a與黑色素瘤耐藥機制模擬圖

王朝研究員、劉昊天博士、王雪琪博士生、滕建謹碩士為文章的共同第一作者。李俊教授、黃丹丹教授和楊吉龍教授為文章的共同通訊作者。

原文鏈接：http://doi.org/10.1002/advs.202515158

制版人：十一

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