幽門螺桿菌是一種定植于人類胃黏膜的革蘭氏陰性菌，全球超過半數(shù)人口感染。它是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤乃至胃癌的主要致病因素，已被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌物。

然而，隨著抗生素的廣泛使用，幽門螺桿菌的耐藥率逐年攀升。臨床上急需新型抗幽門螺桿菌藥物。近年，發(fā)表于International Journal of Molecular Sciences的一項研究，發(fā)現(xiàn)了一種天然香豆素化合物——瑞香素，對多重耐藥幽門螺桿菌臨床分離株具有良好的抗菌活性，并揭示了其獨特的作用機制。

一、研究背景

幽門螺桿菌在高酸胃環(huán)境中長期生存，依賴多種定植因子（如BabA黏附素、UreI尿素通道）和強大的DNA修復系統(tǒng)。傳統(tǒng)抗生素主要通過抑制細胞壁合成、蛋白質合成或核酸復制來殺滅細菌，但耐藥突變不斷出現(xiàn)。瑞香素（7，8-二羥基香豆素）是中國已臨床用于治療血栓閉塞性脈管炎的藥物，具有抗炎、抗腫瘤等多種活性，但此前其對幽門螺桿菌的作用尚不明確。

二、研究目的

本研究旨在評估瑞香素對多重耐藥幽門螺桿菌臨床分離株的抗菌活性，并深入探討其作用機制，包括對細菌形態(tài)、膜結構、DNA損傷、定植相關基因表達及對人胃上皮細胞黏附能力的影響。

三、研究方法

本研究采用20株幽門螺桿菌臨床分離株（含多重耐藥菌株）及標準菌株ATCC43504，同時使用永生化人胃上皮細胞系GES-1。通過瓊脂稀釋法檢測瑞香素、克拉霉素和甲硝唑的最低抑菌濃度。采用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察亞抑菌濃度瑞香素處理后的細菌形態(tài)變化。采用CCK-8法檢測瑞香素對GES-1細胞的細胞毒性。統(tǒng)計方法采用非配對雙尾t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

四、研究結果

1.瑞香素對多重耐藥幽門螺桿菌具有良好的抗菌活性

瑞香素對全部20株臨床分離株的MIC范圍為25~100 μg/ml，無論這些菌株對克拉霉素（耐藥率25%）和甲硝唑（耐藥率85%，其中50%為高水平耐藥）是否耐藥。標準菌株ATCC43504的MIC為25 μg/ml。這表明瑞香素的抗菌活性不受現(xiàn)有抗生素耐藥譜的影響。

2.瑞香素顯著改變幽門螺桿菌的形態(tài)

掃描電鏡顯示，未處理的幽門螺桿菌呈典型的光滑桿狀。經(jīng)6.25 μg/ml或12.5 μg/ml瑞香素處理3天后，細菌出現(xiàn)廣泛的表面損傷、出芽結構，并以濃度依賴性方式轉變?yōu)榍蛐误w（球菌樣形態(tài)）。透射電鏡進一步揭示，12.5 μg/ml瑞香素處理后，細菌體積縮小，外膜粗糙，細胞質呈顆粒狀，膜與細胞質之間出現(xiàn)異常分離，約40%的細菌胞內(nèi)出現(xiàn)大量囊泡或內(nèi)膜“孔洞”，而對照組未見囊泡。

3.瑞香素誘導外膜磷脂酰絲氨酸外翻

使用Annexin V檢測磷脂酰絲氨酸暴露。對照組中僅5.93%的細菌呈陽性，而12.5 μg/ml瑞香素處理后，陽性率驟升至56.99%（P＜0.001），表明外膜結構發(fā)生顯著改變。但膜去極化（DiBAC染色）和蛋白泄漏（BCA法）與對照組無統(tǒng)計學差異，提示瑞香素主要改變外膜脂質不對稱性，而非全面破壞膜通透性。

4.瑞香素引起DNA損傷并上調(diào)RecA

TUNEL染色檢測DNA斷裂：對照組陽性率僅8.11%，瑞香素處理組高達68.02%（流式細胞術），共聚焦顯微鏡也證實了強烈的綠色熒光信號。與此同時，recA基因轉錄水平顯著升高，RecA蛋白產(chǎn)量從對照組的66.9±6.1升至133.1±6.1（P＜0.001）。RecA是細菌SOS反應的核心蛋白，參與DNA修復，其上調(diào)是對DNA損傷的直接響應。

5.瑞香素抑制定植相關基因表達并減少細菌黏附

qPCR顯示，瑞香素顯著降低了babA（編碼黏附素，與胃上皮Lewis b抗原結合）和ureI的mRNA水平。LC-MS/MS證實BabA蛋白產(chǎn)量從113.9±10.8降至86.1±10.8（P＜0.05）。UreI蛋白因溶解性原因未檢出。

功能實驗：將FITC標記的幽門螺桿菌與GES-1人胃上皮細胞共孵育，共聚焦顯微鏡顯示，瑞香素預處理組的細菌黏附數(shù)量明顯少于對照組，證明瑞香素確實削弱了幽門螺桿菌的定植能力。

6.瑞香素對人胃上皮細胞無顯著細胞毒性

在含或不含血清的培養(yǎng)基中，亞抑菌濃度的瑞香素處理GES-1細胞24小時后，細胞存活率約為81%~84%，與對照組相比無顯著差異，表明瑞香素對宿主細胞具有良好的安全性。

參考文獻

Wang G，Pang J，Hu X，etal.Daphnetin：A Novel Anti-Helicobacter pylori Agent[J].Int J Mol Sci，2019，20（4）：850.