2026年6月14日，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染病科、感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點實驗室、病毒性肝炎研究所彭明利、胡鵬、凌寧團隊，聯(lián)合達州市中心醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝科，在Phytomedicine（中科院1區(qū)，TOP期刊，IF=11.3） 發(fā)表題為 “Natural small molecule evodiamine alleviates liver fibrosis by targeting the ANXA2-p110α axis in hepatic stellate cells” 的研究論文。Yong Sun 和 Zongyi Liu 為共同第一作者，Ning Ling、Peng Hu 和 Mingli Peng 為共同通訊作者。該文于2026年4月1日投稿，2026年5月27日修回，2026年6月14日接收。

肝纖維化是多種慢性肝病進展為肝硬化和肝細胞癌的重要病理階段。目前臨床治療仍以病因控制為主，能夠直接干預(yù)纖維化進程的藥物仍然有限。肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化和增殖是細胞外基質(zhì)沉積及肝纖維化進展的核心事件，因此，尋找能夠抑制 HSC 活化的天然小分子，是抗肝纖維化藥物開發(fā)的重要方向。

在本研究中，作者從安絡(luò)化纖丸、扶正化瘀膠囊和鱉甲軟肝片等臨床常用抗纖維化中藥復(fù)方出發(fā)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、TGF-β1 誘導(dǎo)的 HSC 活化模型以及體內(nèi)多模型驗證，系統(tǒng)篩選具有抗纖維化潛力的天然小分子。結(jié)果顯示，在23個優(yōu)先候選化合物中，吳茱萸堿（evodiamine，EVO）對 HSC 活化和增殖表現(xiàn)出最明顯的抑制作用。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，EVO 可顯著降低人源 LX-2 細胞和大鼠 HSC-T6 細胞中 COL1A1、ACTA2（α-SMA）、Collagen I 等纖維化相關(guān)指標(biāo)的表達，并抑制 HSC 增殖。體內(nèi)實驗中，作者分別構(gòu)建了 CCl? 誘導(dǎo)肝纖維化模型、DDC 誘導(dǎo)膽汁淤積性纖維化模型，以及高脂飲食聯(lián)合 CCl? 誘導(dǎo)的 MASH 相關(guān)纖維化模型。EVO 在多個模型中均能改善肝功能指標(biāo)，減輕膠原沉積、肝組織損傷和纖維化病理改變，并且在測試劑量范圍內(nèi)未觀察到明顯系統(tǒng)毒性。

機制方面，研究通過藥物親和響應(yīng)靶點穩(wěn)定性分析（DARTS）、生物層干涉技術(shù)（BLI）、細胞熱轉(zhuǎn)變分析（CETSA）以及分子對接等方法，鑒定膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）為 EVO 的直接結(jié)合靶點。ANXA2 在活化的 HSC 中富集，并在小鼠纖維化肝組織和人類纖維化肝組織標(biāo)本中明顯上調(diào)，其表達與肝纖維化嚴重程度呈正相關(guān)。

作者進一步證明，EVO 可通過涉及 Ser22 和 Val27 的位點結(jié)合 ANXA2，并促進 NEDD4L 介導(dǎo)的 K48 連接泛素化，從而加速 ANXA2 的蛋白酶體降解。同時，EVO 還可破壞 ANXA2 與 PI3K 催化亞基 p110α 之間的相互作用，抑制 PI3K-AKT 信號通路，最終降低 HSC 的活化和增殖。ANXA2 過表達會部分削弱 EVO 的抗纖維化作用，而 ANXA2 抑制或敲低則可模擬 EVO 的部分效應(yīng)，進一步支持 ANXA2 是 EVO 發(fā)揮抗纖維化作用的重要分子靶點。

總體而言，該研究從臨床常用抗纖維化中藥復(fù)方中篩選出天然小分子 EVO，并揭示了其通過靶向 ANXA2-p110α 軸 緩解肝纖維化的新機制。該發(fā)現(xiàn)不僅為理解 EVO 的抗纖維化作用提供了新的分子依據(jù)，也為圍繞 ANXA2 進行抗肝纖維化藥物開發(fā)提供了潛在方向。需要強調(diào)的是，目前研究證據(jù)主要來自細胞實驗和小鼠模型，EVO 的臨床轉(zhuǎn)化價值仍需進一步的藥代動力學(xué)、安全性和長期療效研究加以驗證。

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【摘要】

背景：肝纖維化是慢性肝損傷的常見后果，但目前能夠直接阻斷纖維化發(fā)生發(fā)展的藥物干預(yù)手段仍然有限。

目的：本研究旨在從臨床有效的抗纖維化中藥復(fù)方中篩選能夠抑制肝星狀細胞（HSC）活化的天然化合物，并進一步闡明其潛在作用機制。

研究設(shè)計與方法：研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，并結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子 β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的肝星狀細胞活化模型，篩選天然小分子化合物；隨后在 CCl?、DDC 以及高脂飲食聯(lián)合 CCl?（HFD+CCl?）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中進行體內(nèi)驗證。研究還通過藥物親和響應(yīng)靶點穩(wěn)定性分析（DARTS）、生物層干涉技術(shù)（BLI）和 RNA 測序（RNA-seq）開展直接靶點鑒定和機制分析。

結(jié)果：在 23 個優(yōu)先篩選出的候選化合物中，吳茱萸堿（EVO）顯著抑制了人 LX-2 細胞和大鼠 HSC-T6 細胞中肝星狀細胞的活化與增殖。在 3 種小鼠模型中，EVO（50 mg/kg）明顯改善肝功能和纖維化病理改變，且未引起明顯毒性。膜聯(lián)蛋白 A2（ANXA2）被鑒定為 EVO 的直接結(jié)合靶點；ANXA2 在活化的肝星狀細胞中富集，并在纖維化小鼠肝臟和人類纖維化肝組織標(biāo)本中上調(diào)。機制上，EVO 通過涉及 Ser22 和 Val27 的位點與 ANXA2 結(jié)合，并促進 NEDD4L 介導(dǎo)的 K48 連接泛素化及 ANXA2 降解。此外，EVO 還破壞 ANXA2 與 PI3K 催化亞基 p110α 之間的相互作用，從而抑制肝星狀細胞中的 PI3K-AKT 信號通路。

結(jié)論：本研究鑒定出 EVO 是一種具有抗肝纖維化活性的天然化合物，并揭示了一種此前尚未認識到的機制：EVO 通過靶向肝星狀細胞中的 ANXA2-p110α 軸緩解肝纖維化。

01

研究背景及科學(xué)問題

肝纖維化是慢性肝病進展為肝硬化和肝細胞癌過程中的關(guān)鍵病理階段。目前，肝纖維化的治療仍主要集中在病因干預(yù)層面，而能夠直接減緩纖維化進展的治療方法仍十分有限。在中國臨床實踐中，常用中藥復(fù)方如安絡(luò)化纖丸、扶正化瘀膠囊和鱉甲軟肝片聯(lián)合抗病毒治療，已被報道較單純抗病毒治療更有助于延緩肝纖維化進展。肝星狀細胞的活化和增殖是細胞外基質(zhì)沉積及纖維化進展的關(guān)鍵驅(qū)動因素，因此活化的肝星狀細胞被認為是肝纖維化治療的重要靶點。鑒于天然產(chǎn)物在小分子藥物發(fā)現(xiàn)中的重要價值，從臨床有效的抗纖維化中藥復(fù)方中系統(tǒng)篩選能夠抑制肝星狀細胞活化的天然化合物，是發(fā)現(xiàn)新型抗纖維化先導(dǎo)化合物的一種合理策略。

吳茱萸堿（EVO）是一種從 Tetradium ruticarpum（A.Juss.）T.G.Hartley 中分離得到的吲哚類生物堿，具有抗炎、抗腫瘤和代謝調(diào)節(jié)作用。越來越多的證據(jù)顯示，EVO 在多個器官中具有抗纖維化活性。例如，EVO 可通過調(diào)節(jié) apelin 信號緩解脂多糖誘導(dǎo)的肺纖維化；也可抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞活化和內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而減輕心肌纖維化。此外，少數(shù)研究提示 EVO 可能通過下調(diào) TGF-β1/Smad 信號，減輕肝星狀細胞活化和膠原沉積。然而，這些研究主要描述了 EVO 的藥效和下游通路變化，其在肝星狀細胞中的直接分子靶點仍不清楚。

膜聯(lián)蛋白 A2（ANXA2）是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，參與膜結(jié)構(gòu)組織、細胞骨架重塑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在臨床樣本中，慢性乙型肝炎患者血清 ANXA2 水平升高；在非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎中，肝臟 ANXA2 表達升高，并與纖維化嚴重程度相關(guān)。與此一致，在 CCl? 誘導(dǎo)的肝纖維化和飲食誘導(dǎo)的脂肪肝疾病等實驗?zāi)Ｐ椭?，也觀察到 ANXA2 上調(diào)。PI3K-AKT 通路是驅(qū)動肝星狀細胞活化和纖維化進展的重要信號節(jié)點。已有研究提示 ANXA2 與 PI3K-AKT 相關(guān)信號網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。例如，TIM-4 與 ANXA2 的相互作用可促進 PI3K-AKT 激活和肺癌進展；敲低 ANXA2 則可抑制肝星狀細胞中的 PI3K-AKT 激活。然而，ANXA2 是否在肝星狀細胞中直接與 PI3K 組分偶聯(lián)，從而調(diào)控 PI3K-AKT 活化，目前仍不明確。

因此，本研究旨在從 3 種臨床常用的抗纖維化中藥復(fù)方中篩選作用于肝星狀細胞的天然化合物。通過整合篩選和多模型驗證策略，研究從 23 個優(yōu)先候選化合物中確定 EVO 是具有穩(wěn)定抗纖維化活性的先導(dǎo)候選物。進一步的靶點驗證研究表明，ANXA2 是 EVO 在肝星狀細胞中的直接靶點。機制上，EVO 可促進 NEDD4L 介導(dǎo)的 ANXA2 泛素化和蛋白酶體降解，并破壞 ANXA2-p110α 相互作用，從而抑制 PI3K-AKT 信號。通過這種雙重抑制作用，EVO 抑制肝星狀細胞活化并緩解肝纖維化，為后續(xù)抗纖維化藥物開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

EVO 在體外抑制肝星狀細胞增殖與活化

研究首先建立了天然小分子抗纖維化潛力的篩選流程。研究人員從 TCMSP 和 HERB 數(shù)據(jù)庫中挖掘安絡(luò)化纖丸、扶正化瘀膠囊和鱉甲軟肝片的化學(xué)成分，分別獲得 752、683 和 1058 個化合物。進一步根據(jù)類藥性和 SwissADME 預(yù)測的藥代動力學(xué)性質(zhì)進行篩選后，候選化合物分別縮小至 30、62 和 47 個。隨后，研究整合了來自代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝?。∕ASLD，既往稱為 NAFLD）、酒精性肝病（ALD）和乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)肝纖維化轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中的 2537 個纖維化相關(guān)差異表達基因，并與 1136 個預(yù)測化合物靶點取交集，獲得 180 個共同靶點。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析進一步篩選出 62 個樞紐靶點，并從化合物-樞紐靶點網(wǎng)絡(luò)中選擇 23 個高度連接的化合物用于后續(xù)體外篩選。

在 TGF-β1 激活的 LX-2 細胞中，RT-qPCR 篩選顯示 EVO、大黃素、甜橙黃酮、山柰酚和小檗堿均可明顯降低 COL1A1 和 ACTA2（α-SMA）mRNA 表達。進一步的蛋白水平驗證顯示，在這些候選化合物中，含吲哚結(jié)構(gòu)的生物堿 EVO 具有最顯著的抑制作用。劑量反應(yīng)實驗顯示，在 LX-2 和 HSC-T6 細胞中，10 μM EVO 在不明顯影響細胞活力的情況下，對 collagen I 和 α-SMA 蛋白表達的抑制最強，因此被選為后續(xù)實驗的最佳濃度。此外，EVO 還能逆轉(zhuǎn) TGF-β1 誘導(dǎo)的 LX-2 細胞形態(tài)變化，降低 LX-2、HSC-T6 和原代肝星狀細胞中的 α-SMA 免疫熒光信號，并通過 IncuCyte 活細胞成像和 EdU 摻入實驗顯示出對 LX-2 細胞增殖的抑制作用。與此一致，EVO 還降低了 LX-2 和 HSC-T6 細胞中 PCNA 與 CCND1 的表達，并減少原代肝星狀細胞中 collagen I 和 α-SMA 的蛋白水平?？傮w而言，這些結(jié)果表明，EVO 是抑制肝星狀細胞活化和增殖最有效的候選化合物。

圖1：EVO 的鑒定及體外驗證。（A）整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和 LX-2 細胞篩選以鑒定 EVO 的工作流程。（B）在 TGF-β1 刺激的 LX-2 細胞中，使用 23 個候選化合物（10 μM）處理后，纖維化相關(guān) mRNA 表達的 RT-qPCR 熱圖（n = 3）。（C）LX-2 細胞經(jīng) 5 個候選化合物處理后，α-SMA 和 Collagen I 的代表性 Western blot 結(jié)果。（D）EVO 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。（E）使用 IncuCyte 系統(tǒng)測定的肝星狀細胞標(biāo)準(zhǔn)化融合度。（F）活細胞成像及代表性形態(tài)圖像，顯示 EVO（5 μM 和 10 μM）對 TGF-β1 處理的肝星狀細胞的影響。比例尺：20 μm。（G）EdU 摻入實驗顯示各組細胞增殖情況；DAPI 標(biāo)記細胞核，EdU 標(biāo)記增殖細胞。比例尺：50 μm。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM 表示。統(tǒng)計學(xué)顯著性采用單因素方差分析并進行 Tukey 事后檢驗。*P < 0.05，**P < 0.01，與 TGF-β1 組相比；## < 0.001，與 Con 組相比。

EVO 在多種小鼠肝纖維化模型中緩解肝纖維化

為了評價 EVO 的體內(nèi)抗纖維化作用，研究采用了 3 種小鼠肝纖維化模型：CCl? 誘導(dǎo)的肝纖維化、DDC 誘導(dǎo)的膽汁淤積性纖維化，以及 HFD+CCl? 誘導(dǎo)的代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）相關(guān)纖維化。

根據(jù)既往體內(nèi)給藥方案，研究在 CCl? 誘導(dǎo)的肝纖維化模型中選擇 25、50 和 100 mg/kg 作為低、中、高劑量進行初步劑量評估，并以臨床使用的抗纖維化中藥制劑安絡(luò)化纖丸作為陽性對照。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測和 LC-MS/MS 注釋結(jié)果均提示 EVO 是安絡(luò)化纖丸中的化學(xué)成分。與 CCl? 組相比，不同劑量 EVO 和安絡(luò)化纖丸均在不同程度上降低血清 ALT 和 AST 水平，減輕組織學(xué)肝損傷和膠原沉積，并降低 α-SMA 表達。與此一致，肝組織羥脯氨酸含量降低，肝硬化發(fā)生率從 76.7% 降至 22.0%–48.0%。25 mg/kg 和 50 mg/kg EVO 呈劑量依賴性改善，而 50 mg/kg 與 100 mg/kg 之間未見顯著差異。50 mg/kg 和 100 mg/kg EVO 的改善效果均優(yōu)于安絡(luò)化纖丸。值得注意的是，50 mg/kg EVO 在肝組織 mRNA 和蛋白水平上均顯著下調(diào) Col1a1、Acta2 和 TGF-β。因此，研究在后續(xù)實驗中采用 25 mg/kg 和 50 mg/kg 兩個劑量。

在 DDC 誘導(dǎo)的纖維化模型中，EVO 以劑量依賴方式降低肝重/體重比以及血清 ALT、AST 和 TBA 水平。組織學(xué)分析顯示，EVO 減少膽管周圍膠原積累和卟啉沉積，同時降低 α-SMA 表達。肝組織羥脯氨酸含量和纖維化相關(guān)蛋白水平也相應(yīng)下降。在 HFD+CCl? 誘導(dǎo)的纖維化模型中，EVO 明顯降低血清 ALT 和 AST 水平，減輕肝損傷，減少膠原和脂質(zhì)沉積，并降低肝臟硬度。EVO 還降低肝組織羥脯氨酸含量，使纖維化分級向較低階段轉(zhuǎn)移，在蛋白水平下調(diào) TGF-β、α-SMA 和 collagen I，并改善脂肪變性評分。此外，EVO 顯著降低 TC、TG 和 LDL-C 水平，并改善葡萄糖耐量和胰島素敏感性。

總體來看，EVO 在 3 種模型中均表現(xiàn)出一致的抗纖維化作用。在所測試的劑量范圍內(nèi)，腎功能指標(biāo)未見明顯異常，包括心、肺、脾、腎在內(nèi)的主要器官也未觀察到明顯毒性或組織病理學(xué)異常。

圖2：EVO 在多種小鼠模型中緩解肝纖維化。（A）CCl? 誘導(dǎo)小鼠纖維化模型實驗設(shè)計示意圖。（B）CCl? 誘導(dǎo)纖維化模型中血清 ALT 和 AST 水平（n = 6–8）。（C）各組小鼠肝組織 H&E、Masson 和 α-SMA 染色的代表性圖像。比例尺：200 μm。（D）DDC 誘導(dǎo)小鼠纖維化模型實驗設(shè)計示意圖。（E）DDC 誘導(dǎo)纖維化模型中血清 ALT、AST、TBIL、ALP 和 TBA 水平（n = 3–6）。（F）HFD+CCl? 誘導(dǎo)小鼠纖維化模型實驗設(shè)計示意圖。（G）HFD+CCl? 誘導(dǎo)纖維化模型中血清 ALT 和 AST 水平（n = 3–5）。（H）各組小鼠肝組織 H&E、Sirius Red 和 Oil Red O 染色的代表性圖像。比例尺：200 μm。（I）各組小鼠肝臟超聲彈性成像的代表性圖像。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM 表示。統(tǒng)計學(xué)顯著性采用單因素方差分析并進行 Tukey 事后檢驗。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，與 CCl? 組、DDC 組或 HFD+CCl? 組相比；# < 0.01，## < 0.001，與 Con 組相比。ns 表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

ANXA2 被鑒定為 EVO 的直接作用靶點

為了鑒定 EVO 的分子靶點，研究采用 DARTS 蛋白質(zhì)組學(xué)分析。在被保護的約 35–40 kDa 蛋白區(qū)域中，LC-MS/MS 鑒定出 16 個候選蛋白，其中 ANXA2 排名最高，評分為 83.5。進一步將 EVO 處理組與對照組之間的強度變化，與 MASLD、ALD 和 HBV 相關(guān)纖維化轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集交叉分析，候選靶點縮小為 4 個：ALDOC、ANXA2、BUB3 和 IKBIP。其中，ANXA2 在 EVO 與對照之間的強度變化明顯，并且在多個公開 GEO 數(shù)據(jù)集中隨纖維化進展呈一致上調(diào)。

多種相互獨立的實驗進一步支持 EVO 與 ANXA2 存在相互作用。分子對接預(yù)測 EVO 可結(jié)合在 ANXA2 N 端附近，并涉及 Ser22 和 Val27 位點，結(jié)合能為 -6.7 kcal/mol；BLI 進一步證實二者呈濃度依賴性結(jié)合，解離常數(shù) K? 為 60.25 μM。在 DARTS-Western blot 實驗中，EVO 提高了 ANXA2 對蛋白酶消化的抵抗能力；細胞熱轉(zhuǎn)變分析（CETSA）顯示 EVO 增強了 ANXA2 的熱穩(wěn)定性。為了驗證預(yù)測的結(jié)合殘基，研究采用帶 Flag 標(biāo)簽的野生型 ANXA2 以及 Ser22/Val27 突變型 ANXA2 進行 CETSA 分析，結(jié)果顯示雙突變可消除 EVO 誘導(dǎo)的 ANXA2 熱穩(wěn)定性增強，提示 Ser22 和 Val27 是 EVO 與 ANXA2 結(jié)合的關(guān)鍵殘基。公開 GEO 數(shù)據(jù)集進一步顯示，在 MASLD、ALD 和 HBV 相關(guān)纖維化患者中，ANXA2 表達隨纖維化嚴重程度升高而增加。在 HBV 數(shù)據(jù)集中，ANXA2 表達與 COL1A1、ACTA2 以及纖維化分期呈正相關(guān)。臨床肝組織標(biāo)本同樣顯示，ANXA2 表達隨纖維化分期加重而升高。綜合來看，這些結(jié)果支持 ANXA2 是 EVO 的直接結(jié)合靶點。

圖3：EVO 直接靶向 ANXA2。（A）DARTS 聯(lián)合 LC-MS/MS 用于靶點鑒定的流程示意圖。（B）LX-2 細胞中 DARTS 實驗的銀染結(jié)果。（C）質(zhì)譜分析鑒定出的前 8 個候選靶點。（D）整合 DARTS 命中蛋白與纖維化相關(guān) GEO 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集（MASLD/ALD/HBV）進行候選靶點篩選。（E）EVO 與 ANXA2 的分子對接結(jié)果。（F）BLI 分析 EVO 與 ANXA2 的結(jié)合。（G）在有或無 EVO（50 μM）條件下，用不同劑量蛋白酶消化 LX-2 細胞裂解物，隨后通過 Western blot 檢測 ANXA2 蛋白水平。（H）EVO（50 μM）處理后 ANXA2 的 CETSA 分析。（I）CETSA 分析 EVO（50 μM）與野生型 ANXA2（Flag-ANXA2WT）或 Ser22/Val27 突變型 ANXA2（Flag-ANXA22A）在細胞內(nèi)的結(jié)合。（J）根據(jù)纖維化分期/分級分層的公開轉(zhuǎn)錄組隊列中 ANXA2 表達情況；下方圖顯示在 GSE84044 隊列中，ANXA2 表達與纖維化相關(guān)標(biāo)志物 ACTA2 和 COL1A1 以及纖維化分期之間的 Spearman 相關(guān)分析。（K）不同纖維化分期人肝組織中 ANXA2 免疫組織化學(xué)染色的代表性圖像。比例尺：50 μm。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析按方法部分所述進行。相關(guān)性采用 Spearman 秩相關(guān)檢驗評估。

EVO 通過靶向 ANXA2 抑制肝星狀細胞活化并緩解肝纖維化

在 CCl? 誘導(dǎo)的纖維化小鼠肝臟和肝硬化人肝組織的單細胞 RNA 測序分析中，ANXA2 在活化的肝星狀細胞中富集。這些活化肝星狀細胞由 COL1A1、COL1A2 和 TIMP1 等細胞外基質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物識別。與此一致，TGF-β1 可提高 LX-2 細胞中 ANXA2 的表達，而 EVO 則抑制 ANXA2 上調(diào)。在 CCl?、DDC 和 HFD+CCl? 誘導(dǎo)的纖維化模型中，ANXA2 蛋白水平均明顯升高，并被 EVO 降低。盡管已有研究提示肝細胞中的 ANXA2 參與 MASLD/MASH 進展，但在本研究的纖維化模型中，ANXA2 染色主要富集于 α-SMA 陽性區(qū)域，提示其與活化肝星狀細胞密切相關(guān)。

為了檢驗 EVO 的抗纖維化作用是否依賴 ANXA2，研究開展了挽救實驗。在體外實驗中，EVO 處理和 ANXA2 敲低均可抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的促纖維化蛋白表達，而 ANXA2 過表達可部分逆轉(zhuǎn) EVO 的抑制作用。在 CCl? 模型中，研究使用 AAV6-Postn 載體，使 ANXA2 主要在活化肝星狀細胞/肌成纖維細胞區(qū)室中過表達。EGFP 報告信號顯示，ANXA2 過表達主要位于 α-SMA 陽性纖維化區(qū)域。與 CCl? 組相比，ANXA2 過表達與血清 ALT 和 AST 持續(xù)升高、肝組織結(jié)構(gòu)破壞加重、膠原沉積增加以及 α-SMA 陽性區(qū)域擴大有關(guān)。肝組織羥脯氨酸含量以及 α-SMA 和 collagen I 水平也呈上升趨勢。EVO 可明顯減輕肝損傷和纖維化，但 ANXA2 過表達會部分削弱這些獲益。此外，ANXA2 抑制劑 LCKLSL 可減輕 CCl? 模型中的組織學(xué)纖維化，進一步支持 ANXA2 在肝纖維化進展中的促纖維化作用。

圖4：EVO 通過 ANXA2 抑制肝星狀細胞活化，從而緩解肝纖維化。（A）UMAP 特征圖顯示公開小鼠肝臟單細胞 RNA 測序數(shù)據(jù)集（GSE171904）中 ANXA2 及纖維化相關(guān)標(biāo)志物 COL1A1、COL1A2、TIMP1 的表達。（B）CCl?、DDC 和 HFD+CCl? 模型肝組織中 ANXA2 的代表性 Western blot 結(jié)果（n = 3）。（C）各模型及處理組肝切片中 ANXA2（綠色）和 α-SMA（紅色）與 DAPI（藍色）的代表性免疫熒光染色圖像。比例尺：50 μm。（D）CCl? 模型中 AAV6-ANXA2 遞送及藥物處理（EVO 或 LCKLSL）的示意圖。（E）各組血清 ALT 和 AST 水平（n = 3–5）。（F）各組小鼠肝組織 H&E、Sirius Red 和 α-SMA 染色的代表性圖像。比例尺：200 μm。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM 表示。統(tǒng)計學(xué)顯著性采用單因素方差分析并進行 Tukey 事后檢驗。**P < 0.01，與 CCl? 組相比；# < 0.01，與 Con 組相比；&&P < 0.01，與 EVO 組相比。

EVO 促進 NEDD4L 介導(dǎo)的 ANXA2 K48 連接泛素化與蛋白酶體降解

為了探究 EVO 如何調(diào)控 ANXA2 蛋白水平，研究檢測了 ANXA2 mRNA 表達及翻譯后蛋白穩(wěn)定性。RT-qPCR 結(jié)果顯示，在 TGF-β1 處理的 LX-2 細胞中，ANXA2 mRNA 水平?jīng)]有顯著變化；而環(huán)己酰亞胺（CHX）追蹤實驗顯示，EVO 處理降低了 ANXA2 蛋白穩(wěn)定性，并加速其降解。值得注意的是，EVO 結(jié)合殘基 Ser22 和 Val27 突變后，EVO 誘導(dǎo)的 ANXA2 降解被減弱。既往研究提示 ANXA2 可通過泛素-蛋白酶體途徑降解，但 EVO 是否促進 ANXA2 泛素化仍不清楚。因此，研究分別使用 MG132 和 CQ 阻斷蛋白酶體和溶酶體途徑。結(jié)果顯示，MG132 可拮抗 EVO 誘導(dǎo)的 ANXA2 下調(diào)，而 CQ 無明顯影響。此外，EVO 明顯增加 ANXA2 多聚泛素化，提示 EVO 增強了 ANXA2 的泛素依賴性蛋白酶體周轉(zhuǎn)。

泛素化過程中的底物特異性主要由 E3 泛素連接酶決定。為了鑒定負責(zé) ANXA2 降解的關(guān)鍵 E3 連接酶，研究利用 UbiBrowser 預(yù)測可能與 ANXA2 相互作用的 E3 連接酶，并選擇排名前 10 的候選者。將預(yù)測結(jié)果與 RNA-seq 數(shù)據(jù)整合后發(fā)現(xiàn)，在 TGF-β1 處理的 LX-2 細胞中，EVO 顯著上調(diào) NEDD4L mRNA。敲低 NEDD4L 可恢復(fù) EVO 處理下的 ANXA2 蛋白水平，提示 NEDD4L 對 EVO 誘導(dǎo)的 ANXA2 降解是必需的。共免疫沉淀進一步顯示，EVO 增強了 ANXA2 與 NEDD4L 之間的相互作用。由于已有研究報道 ANXA2 可被 K48 和 K63 多聚泛素鏈修飾，研究進一步檢測了這兩類泛素鏈。結(jié)果顯示，EVO 增強了 ANXA2 上的 K48 泛素鏈，而 K63 泛素鏈基本無變化。更重要的是，NEDD4L 敲低降低了 EVO 誘導(dǎo)的 ANXA2 K48 連接泛素化?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明，EVO 通過 NEDD4L 介導(dǎo)的 K48 連接泛素化促進 ANXA2 降解。

圖5：EVO 促進 NEDD4L 介導(dǎo)的 ANXA2 泛素化和蛋白酶體降解。（A）RT-qPCR 分析 LX-2 細胞在指定條件下處理 24 h 后 ANXA2 mRNA 水平（n = 3）。（B）在 EVO（10 μM）處理后，于指定時間點進行環(huán)己酰亞胺追蹤實驗（CHX；25 μg/mL），評估 ANXA2 蛋白穩(wěn)定性，隨后進行 Western blot 檢測。（C）在 EVO（10 μM）處理后，于指定時間點進行環(huán)己酰亞胺追蹤實驗（CHX；25 μg/mL），評估帶 Flag 標(biāo)簽的野生型 ANXA2（Flag-ANXA2WT）或 Ser22/Val27 突變型 ANXA2（Flag-ANXA22A）的蛋白穩(wěn)定性，隨后進行 Western blot 檢測。（D–E）在蛋白酶體抑制劑 MG132（10 μM）或溶酶體抑制劑 CQ（50 μM）存在條件下，LX-2 細胞經(jīng) EVO（10 μM）處理后 ANXA2 的代表性 Western blot 結(jié)果。（F）在 EVO（10 μM）處理的 LX-2 細胞中，通過 Co-IP 檢測 ANXA2 泛素化。（G）ANXA2 相關(guān) E3 連接酶的生物信息學(xué)預(yù)測以及基于 RNA-seq 的 mRNA 表達變化。（H）代表性 Western blot 顯示 NEDD4L 敲低對 EVO（10 μM）處理的 LX-2 細胞中 ANXA2 蛋白水平的影響。（I）Co-IP 實驗用于評估 EVO（10 μM）對 LX-2 細胞中內(nèi)源性 ANXA2 與內(nèi)源性 NEDD4L 相互作用的影響。（J–K）通過 Co-IP 后分別檢測 K48 連接 Ub（J）或 K63 連接 Ub（K）的免疫印跡，評估指定條件下 ANXA2 的泛素鏈連接類型特異性泛素化。（L）在有或無 NEDD4L 敲低條件下，EVO（10 μM）處理后通過 Co-IP 并檢測 K48 連接 Ub，評估 ANXA2 的 K48 連接泛素化。數(shù)據(jù)以均值 ± SEM 表示。統(tǒng)計學(xué)顯著性采用單因素方差分析并進行 Tukey 事后檢驗。ns 表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

EVO 以 ANXA2 依賴方式抑制 PI3K-AKT 信號

為了探究 EVO 如何通過 ANXA2 改善肝纖維化，研究利用京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析篩選下游信號。EVO 預(yù)測靶點與 MASLD、ALD 和 HBV 相關(guān)纖維化數(shù)據(jù)集中的纖維化相關(guān)基因富集分析均一致指向 PI3K-AKT 通路。單細胞分析進一步支持這一信號：區(qū)分活化肝星狀細胞與靜息肝星狀細胞的基因顯著富集于 PI3K-AKT 信號通路，提示該通路與肝星狀細胞活化狀態(tài)密切相關(guān)。與這些觀察結(jié)果一致，在 TGF-β1 刺激的 LX-2 細胞中，RNA-seq 顯示 EVO 處理和 ANXA2 敲低均顯著影響 PI3K-AKT 信號相關(guān)基因集。

RNA-seq 進一步顯示，EVO 處理和 ANXA2 敲低均降低了 COL1A1、COL3A1 和 ACTA2 等纖維化相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的表達。值得注意的是，這兩種處理均未降低編碼 PI3K 催化亞基和調(diào)節(jié)亞基的基因 mRNA 水平，包括 PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD 以及 PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3；其抑制作用更多體現(xiàn)在下游或功能性通路基因，如 AKT、CDK 等。RT-qPCR 結(jié)果與 RNA-seq 數(shù)據(jù)趨勢一致。雖然 PI3K 亞基轉(zhuǎn)錄本未下降，但 EVO 處理或 ANXA2 敲低抑制了 p-PI3K 水平，并顯著降低總 AKT 和 p-AKT，聯(lián)合處理時效果更強。相反，ANXA2 過表達可部分逆轉(zhuǎn) EVO 對這些蛋白的抑制作用。與此一致，EVO 在細胞和多種纖維化小鼠模型中均抑制 PI3K-AKT 激活。

為了驗證 PI3K-AKT 信號是 EVO 的下游作用通路，研究進行了藥理學(xué)擾動實驗。PI3K 抑制劑 LY294002 可模擬 EVO 的作用，抑制 PI3K-AKT 激活并減輕促纖維化表型。相反，PI3K 激動劑 740Y-P 可部分抵消 EVO 介導(dǎo)的通路抑制，并削弱 EVO 誘導(dǎo)的抗纖維化反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)提供了功能性證據(jù)，說明 PI3K-AKT 信號是 EVO-ANXA2 軸調(diào)控肝星狀細胞活化和纖維化輸出的重要下游通路。

圖6：EVO 通過 ANXA2 抑制 PI3K-AKT 信號。（A）EVO 相關(guān)靶點的 KEGG 通路富集分析。（B–D）HBV（B）、ALD（C）和 MASLD（D）GEO 隊列中纖維化相關(guān)差異表達基因的 KEGG 通路富集分析。（E）來自單細胞 RNA 測序和 RNA-seq 的差異表達基因 KEGG 富集分析。（F–G）熱圖顯示在指定條件下 LX-2 細胞中纖維化相關(guān)基因（F）和 PI3K-AKT 通路組分（G）的 mRNA 表達變化。（H）LX-2 細胞轉(zhuǎn)染 siANXA2-1 或 siANXA2-2，并在有或無 EVO（10 μM）條件下處理 48 h，隨后對指定蛋白進行免疫印跡檢測（n = 3）。（I）LX-2 細胞轉(zhuǎn)染 OE-ANXA2，并在有或無 EVO（10 μM）條件下處理 48 h，隨后對指定蛋白進行免疫印跡檢測（n = 3）。（J–K）LX-2 細胞使用 PI3K 抑制劑 LY294002（J）或 PI3K 激活劑 740Y-P（K）處理，同時有或無 EVO（10 μM）共同處理 24 h，隨后對指定蛋白進行免疫印跡檢測（n = 3）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，與 TGF-β1 組相比。

EVO 破壞肝星狀細胞中的 ANXA2-p110α 相互作用

PI3K-AKT 信號參與肝星狀細胞活化和纖維化進展，而 PI3K 激活可由上游信號在質(zhì)膜處啟動。考慮到 ANXA2 具有膜定位特性，研究提出假設(shè)：ANXA2 可能作為連接 EVO 與 PI3K 激活的介質(zhì)。分子對接分析提示，ANXA2 更傾向于與 PI3K 催化亞基 p110α（PIK3CA）相互作用，涉及 Asn345、Ser379、Arg382 和 His450 等殘基，其得分/置信度和構(gòu)象穩(wěn)定性高于其他催化亞型 PIK3CB、PIK3CD 或調(diào)節(jié)亞基 PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3。

共免疫沉淀證實，內(nèi)源性 ANXA2 與 p110α 之間存在相互作用，而 EVO 處理可削弱這種相互作用。與此一致，F(xiàn)lag-IP 實驗顯示，EVO 減弱 p110α 與野生型 ANXA2 的相互作用，而在 Ser22/Val27 突變型 ANXA2 構(gòu)建體中，這種抑制作用被減弱，提示 Ser22/Val27 區(qū)域參與 EVO 對 ANXA2-p110α 復(fù)合物形成的干擾。使用重組蛋白進行 BLI 分析顯示，ANXA2 與 p110α 呈濃度依賴性相互作用。預(yù)先將 ANXA2 與 250–1000 μM EVO 孵育，可劑量依賴性降低結(jié)合響應(yīng)，表現(xiàn)為結(jié)合信號降低和最大結(jié)合水平下降。相比之下，不同 EVO 條件下的解離曲線大體相似，提示 EVO 主要限制 ANXA2-p110α 復(fù)合物形成，而不是在結(jié)合發(fā)生后顯著加速其解離。

在功能層面，EVO 處理和 ANXA2 敲低均降低 TGF-β1 激活的 LX-2 細胞中 p110α 蛋白水平，聯(lián)合處理時降低更明顯。相反，ANXA2 過表達或 PI3K 激動劑 740Y-P 可部分恢復(fù) EVO 處理下 p110α 蛋白豐度。CHX 追蹤實驗進一步顯示，ANXA2 敲低加速 p110α 蛋白降解，提示 ANXA2 有助于維持 p110α 蛋白穩(wěn)定性。與此一致，EVO 在活化 LX-2 細胞和多種纖維化小鼠模型中均降低 p110α 蛋白豐度。在 CCl? 誘導(dǎo)的纖維化肝臟中，多色免疫熒光顯示，ANXA2 和 p110α 在 α-SMA 陽性星狀細胞中共定位，而 EVO 處理顯著降低這種共定位?？傮w而言，這些結(jié)果表明，EVO 可直接干擾 ANXA2-p110α 復(fù)合物形成，同時 ANXA2 也參與維持 p110α 蛋白穩(wěn)定性。

圖7：EVO 破壞肝星狀細胞和纖維化肝臟中的 ANXA2-p110α 軸。（A）ANXA2 與 p110α 的分子對接結(jié)果。（B）Co-IP 實驗用于評估 EVO（10 μM）對 LX-2 細胞中內(nèi)源性 ANXA2 與內(nèi)源性 p110α 相互作用的影響。（C）Co-IP 實驗用于評估 EVO（10 μM）對 LX-2 細胞中 p110α 與帶 Flag 標(biāo)簽的野生型 ANXA2（Flag-ANXA2WT）或 Ser22/Val27 突變型 ANXA2（Flag-ANXA22A）相互作用的影響。（D）基于 BLI 的 ANXA2 與 p110α 結(jié)合實驗示意圖。（E）在指定 ANXA2 濃度下，BLI 分析 ANXA2 與 p110α 的結(jié)合。（F）在有或無指定濃度 EVO 條件下，BLI 分析 ANXA2 與 p110α 的結(jié)合。（G）LX-2 細胞轉(zhuǎn)染 siANXA2-1 或 siANXA2-2，并在有或無 EVO（10 μM）條件下處理 48 h，隨后通過免疫印跡檢測 p110α（n = 3）。（H）LX-2 細胞轉(zhuǎn)染 OE-ANXA2，并在有或無 EVO（10 μM）條件下處理 48 h，隨后通過免疫印跡檢測 p110α（n = 3）。（I）在 ANXA2 敲低后，于指定時間點進行環(huán)己酰亞胺追蹤實驗（CHX；25 μg/mL），評估 p110α 蛋白穩(wěn)定性，隨后進行 Western blot 檢測。（J）各組肝切片中 ANXA2（綠色）、α-SMA（紅色）、p110α（品紅色）和 DAPI（藍色）的代表性多重免疫熒光染色圖像。比例尺：100 μm（n = 3）。

機制示意圖總結(jié)

結(jié)合上述結(jié)果，研究提出 EVO 緩解肝纖維化的關(guān)鍵機制：EVO 直接靶向 ANXA2，一方面促進 NEDD4L 介導(dǎo)的 ANXA2 K48 連接泛素化和蛋白酶體降解，另一方面破壞 ANXA2 與 PI3K 催化亞基 p110α 的相互作用，從而抑制 PI3K-AKT 信號，最終降低肝星狀細胞的增殖與活化，并減輕肝纖維化。

圖8：示意圖總結(jié) EVO 如何緩解肝星狀細胞活化和肝纖維化。

【貢獻】★★★★★

總之，本研究揭示了一種此前尚未認識到的機制：EVO 通過靶向 ANXA2，促進其泛素依賴性降解，并破壞 ANXA2-p110α 相互作用，從而抑制 PI3K-AKT 信號并緩解肝纖維化。這些發(fā)現(xiàn)支持 EVO 作為一種抗纖維化候選化合物，并為理解肝纖維化中的 EVO-ANXA2-p110α 軸提供了新的機制依據(jù)。

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