2026年3月3日，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)蔡本志、楊寶峰、潘振偉團隊在藥學(xué)領(lǐng)域權(quán)威期刊Acta Pharmaceutica Sinica B（中科院1區(qū)，IF=14.6）在線發(fā)表題為 “Photobiomodulation-reprogrammed extracellular vesicles delivered via a biodegradable microneedle patch promote cardiac repair by enhancing glycolytic metabolism” 的研究論文。該研究聚焦心肌梗死后心肌修復(fù)過程中干細胞來源細胞外囊泡產(chǎn)量低、活性不足及局部滯留差等臨床轉(zhuǎn)化瓶頸，圍繞綠光光生物調(diào)節(jié)如何重編程人胚胎干細胞來源細胞外囊泡，并通過可降解水凝膠微針貼片實現(xiàn)梗死心肌精準、持續(xù)遞送展開系統(tǒng)研究。研究發(fā)現(xiàn)，綠光重編程后的細胞外囊泡富集miR-423-3p，可通過調(diào)控ZBTB7A/PKM2軸增強心肌細胞糖酵解代謝，促進心肌細胞增殖和血管新生，同時抑制心肌細胞凋亡，最終顯著改善心肌梗死后的心臟功能。該研究將光生物調(diào)節(jié)、細胞外囊泡工程和可降解微針遞送平臺有機結(jié)合，為缺血性心臟病的精準修復(fù)和再生治療提供了全新策略。

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【摘要】

干細胞衍生的細胞外囊泡（EVs）在心肌梗死（MI）的治療中具有巨大的潛力。然而，高效生產(chǎn)具有高生物活性的EVs仍然是限制其臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵瓶頸。在此，我們證明了在綠光條件下進行的光生物調(diào)節(jié)（PBM）能夠激活人類胚胎干細胞（hESCs），使其分泌更多具有卓越心肌保護活性的EVs。這些經(jīng)PBM重編程的hESC-EVs通過促進心肌細胞增殖和血管生成，同時抑制細胞凋亡，改善了小鼠MI模型的心臟恢復(fù)情況。值得注意的是，我們驗證了這些EVs同樣能增強人類心肌細胞的存活和增殖，突顯了其臨床轉(zhuǎn)化潛力。進一步的分析揭示，這種益處歸因于重編程的hESC-EVs中含有較高的miR-423-3p，該物質(zhì)通過調(diào)節(jié)ZBTB7A/PKM2軸增強糖酵解代謝并恢復(fù)線粒體功能。此外，我們合成了一種具有優(yōu)越生物相容性、生物可降解性和機械強度的甲基丙烯酰水凝膠微針貼片，用于負載hESC-EVs，并通過改進的遞送裝置將該貼片輸送至梗死心臟。該系統(tǒng)確保了EVs向缺血心肌的精準和持續(xù)遞送，為MI提供了一種強有力的治療方法?？偠灾@種基于光學(xué)和生物材料的方法有效制備了具有更高心肌保護活性的EVs，為心臟疾病提供了新的治療策略。

(圖文摘要說明：綠光重編程的人類胚胎干細胞來源的細胞外囊泡（hESC-EVs），被封裝在三維GelMA微針中并通過真空輔助遞送，通過miR-423-3p/ZBTB7A/PKM2軸增強糖酵解，從而促進心臟修復(fù)。)

01

研究背景及科學(xué)問題

心肌梗死（MI）是全球發(fā)病率和死亡率的首要原因，對患者的健康和生活質(zhì)量構(gòu)成嚴重威脅。在MI的病理過程中，由于持續(xù)的缺血和缺氧損傷，大量功能性心肌細胞（CMs）發(fā)生壞死和凋亡。缺失的CMs隨后被纖維瘢痕組織替代，導(dǎo)致心室重塑、心臟功能下降，并最終引發(fā)心力衰竭。盡管在外科、介入和藥理學(xué)治療方面取得了顯著進展，但這些方法仍無法彌補MI后心肌細胞的丟失。幾十年來，基于干細胞的再生醫(yī)學(xué)為MI治療帶來了曙光。移植的干細胞通過肌力偶聯(lián)和旁分泌作用，促進心肌收縮和血管生成，從而改善心臟功能。胚胎干細胞（ESCs）是一種來源于人類囊胚內(nèi)細胞團的多能細胞，已被探索用于多種疾病的細胞治療，包括年齡相關(guān)性黃斑變性、脊髓損傷和1型糖尿病。值得注意的是，ESCs由于其自我更新和分化能力，在心臟修復(fù)方面也具有巨大前景。然而，它們的臨床應(yīng)用受到一些挑戰(zhàn)的限制，包括免疫排斥和致瘤性的顯著風(fēng)險、不理想的生物分布與定植，以及倫理問題。

細胞外囊泡（EVs）是帶有脂質(zhì)雙分子層的微小膜泡，攜帶著蛋白質(zhì)、mRNA、非編碼RNA和脂質(zhì)，是細胞間信息傳遞和物質(zhì)交換的重要介質(zhì)。源自干細胞的EVs已顯示出可觀的治療特性，且安全性問題較少，具有“現(xiàn)成可用”的便利性。最近的一項研究表明，由胚胎干細胞分泌的EVs（ESC-EVs）能有效改善衰老小鼠的年齡相關(guān)病理表型并挽救其轉(zhuǎn)錄組譜。此外，ESC-EVs還被證明具有一定的抗腫瘤特性。在Khan等人的研究中，發(fā)現(xiàn)小鼠ESC-EVs能增強新生血管形成和CM存活，同時減少纖維化，從而改善MI后的心臟功能。因此，基于EV的“無細胞”治療策略憑借其優(yōu)越的生物相容性，可能成為臨床治療中ESCs的理想替代品。盡管如此，用于心臟修復(fù)的EV治療通常受到產(chǎn)量低、半衰期短和組織滯留性差等幾項挑戰(zhàn)的制約。為了達到治療效果，需要反復(fù)給藥，而多劑量的EV心內(nèi)注射屬于高侵入性且耗時的手術(shù)。因此，許多研究開始致力于通過各種條件提升干細胞衍生EVs的治療效果。

光生物調(diào)節(jié)（PBM）是一種非侵入性療法，利用特定波長內(nèi)低強度、生物相容的光線穿透組織并與細胞內(nèi)的發(fā)色團相互作用。這種相互作用觸發(fā)一系列光物理和光化學(xué)事件，最終調(diào)節(jié)各種細胞和組織的命運。研究表明，PBM可以誘導(dǎo)多種積極的生物反應(yīng)，包括增強細胞增殖、促進代謝過程和減輕炎癥反應(yīng)。因此，這項技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于臨床以促進傷口愈合、緩解疼痛以及促進肌肉和神經(jīng)組織的再生。值得注意的是，通過激光或發(fā)光二極管（LEDs）實施的PBM，也被認為是一種能夠有效調(diào)節(jié)干細胞生物學(xué)特征和功能的有力工具，且獨立于基因或藥物干預(yù)。然而，目前的研究主要集中在PBM對干細胞的直接細胞內(nèi)作用。PBM是否會影響ESCs的分泌功能，從而改變其衍生EVs的組成和生物學(xué)功能，仍有待探索。此外，除了調(diào)節(jié)EVs的生物活性外，應(yīng)用先進的遞送系統(tǒng)來增強EVs在損傷部位的滯留并實現(xiàn)持續(xù)釋放同樣至關(guān)重要。近年來，微針（MN）貼片已成為再生醫(yī)學(xué)中一種有前景的長期局部藥物遞送平臺。它們提供了微創(chuàng)的進入方式、對藥物釋放的時空控制以及改善的局部滯留性，已成功應(yīng)用于糖尿病和慢性難治性傷口的修復(fù)。受這些進展的鼓舞，我們認為將這種功能平臺應(yīng)用于心臟遞送可以克服直接注射EV進行心肌修復(fù)的局限性。

在本研究中，我們開發(fā)了一種用PBM處理人類胚胎干細胞（hESCs）并隨后分離其釋放的EVs的方案。我們的結(jié)果表明，波長為520 nm的光（綠光）進行PBM能夠刺激hESCs產(chǎn)生具有增強生物活性的EVs。這些EVs通過調(diào)節(jié)糖酵解代謝和線粒體穩(wěn)態(tài)，促進了心肌細胞周期重新進入、抑制心肌細胞凋亡并促進血管生成，從而顯著恢復(fù)了MI后的心臟功能。此外，為了解決局部心肌內(nèi)注射EVs后組織滯留率低的問題，我們制備了一種具有優(yōu)異生物相容性、生物可降解性和機械強度的甲基丙烯酰明膠（GelMA）微針貼片，用于負載hESC-EVs，然后通過一種改良裝置將貼片附著在梗死心臟上。GelMA微針貼片通過實現(xiàn)hESC-EVs的靶向和持續(xù)釋放，增強了其對MI的治療功效。總而言之，我們的發(fā)現(xiàn)證明，這種基于光學(xué)和生物材料的方法可以有效制備具有更高心肌保護活性的EVs，用于治療缺血性心臟病。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

3.1 綠光介導(dǎo)的光生物調(diào)節(jié)增強了hESC-EVs的心肌保護活性

首先，我們通過超速離心從未經(jīng)處理的H9-hESCs條件培養(yǎng)基中分離出hESC-EVs。透射電子顯微鏡（TEM）觀察顯示，hESC-EVs呈現(xiàn)典型的杯狀囊泡結(jié)構(gòu)。同時，納米顆粒跟蹤分析（NTA）顯示其粒徑呈單峰鐘形分布，集中在100 nm左右，證實了hESC-EVs的成功純化。為了確定hESC-EVs對CMs的最佳干預(yù)劑量，我們使用CCK-8檢測評估了用不同濃度的hESC-EVs處理后CM的存活率。結(jié)果顯示hESC-EVs以劑量依賴的方式增強CM活力，在終濃度為$3\times10^9$ particles/mL時觀察到最顯著的作用，這被選為我們后續(xù)研究的濃度。隨后，為了評估PBM是否影響hESC-EVs的生物活性，我們將hESCs暴露在多種波長的光下，包括綠光（520 nm）、紅光（630 nm）、黃光（590 nm）和藍光（470 nm）。然后收集每個照射組的等量EVs用于處理CMs 48小時。結(jié)果顯示，與無光和其它波長光處理的組相比，在$2.5 mW/cm^2$的功率密度下暴露于綠光的hESCs所衍生的EVs顯著提高了CM的活力。為進一步確定最佳照射持續(xù)時間，我們評估了在不同持續(xù)時間的綠光照射下hESC-EVs的生物活性。CCK-8檢測顯示，與其它組的等量EVs相比，暴露于綠光30分鐘的hESCs衍生的EVs顯著提高了CM的活力。隨后的NTA顯示，EV的產(chǎn)量也在30分鐘時達到峰值。因此，選擇30分鐘的綠光照射（520 nm，$2.5 mW/cm^2$）來刺激我們后續(xù)實驗中的hESCs，這些經(jīng)PBM重編程的hESC-EVs被命名為PbEE。

我們進一步表征了PbEE的形態(tài)。TEM和NTA均顯示PbEE展示出與對照hESC-EVs（CEE）相當(dāng)?shù)男螒B(tài)特征和粒徑分布。蛋白質(zhì)印跡（Western blot）分析顯示，來自相同數(shù)量H9-hESCs的PbEE中EV標(biāo)志物（Flotillin-1、TSG101、CD63）的水平高于CEE。在H1-hESCs中得到了高度一致的結(jié)果，進一步證實了綠光照射增強了hESCs的EV產(chǎn)量。為確定PbEE和CEE對CMs的生物活性，我們使用膜特異性熒光探針（EV-Tracker）標(biāo)記這些EVs。孵育12小時后，在心肌細胞骨架中檢測到了EVs的紅色熒光信號。同樣，在CMs中也觀察到了來自GFP-CD63標(biāo)記的EVs的綠色熒光，表明EVs被成功內(nèi)化。隨后，用等量顆粒數(shù)的CEE或PbEE分別處理CMs 48小時。與CEE相比，PbEE顯著增加了CMs中增殖標(biāo)志物EdU、Ki67和pH3的陽性率。此外，在缺氧條件下，與CEE相比，PbEE進一步減少了TUNEL陽性CMs的數(shù)量。在源自H1-hESCs的PbEE中進一步驗證了一致的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)表明，在促進細胞周期激活和抑制CM凋亡方面，PbEE相比等量CEE具有更優(yōu)越的生物活性。

圖1 綠光誘導(dǎo)人胚胎干細胞（hESCs）分泌具有增強心臟保護活性的細胞外囊泡（EVs）。

（A）光生物調(diào)節(jié)重編程hESC來源EVs（PbEE）的制備與提取流程。使用BioRender.com繪制。（B）PbEE和對照hESC來源EVs（CEE）的代表性透射電子顯微鏡（TEM）圖像。比例尺：200 nm。（C）PbEE和CEE的納米顆粒追蹤分析（NTA）結(jié)果。（D，E）來源于等量H9-hESCs的EVs中Flotillin-1、TSG101和CD63的Western blot分析（n=4–5）。（F）EV-tracker標(biāo)記的EVs（紅色）與新生小鼠心肌細胞共培養(yǎng)12 h后的內(nèi)吞情況。綠色：Alpha Actinin；藍色：DAPI。比例尺：10 μm。（G–J）采用EdU、Ki67和pH3染色（紅色）評估等劑量CEE和PbEE處理后心肌細胞增殖的代表性圖像及定量分析（3×10? particles/mL；n=6）。白色箭頭：陽性細胞。比例尺：主圖20 μm，放大圖10 μm。（K，L）TUNEL染色（紅色）檢測心肌細胞凋亡的代表性圖像及定量分析（n=6）。比例尺：50 μm。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.2 PbEE在體外表現(xiàn)出比CEE更強的促血管生成活性

鑒于血管生成在MI后心臟修復(fù)中的關(guān)鍵作用，我們進一步比較了PbEE和CEE對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的促血管生成作用。在與Tracker探針標(biāo)記的EVs孵育6小時后，在HUVECs內(nèi)觀察到明顯的紅色熒光信號，表明EV的內(nèi)吞作用。然后，將HUVECs接種在涂有Matrigel的板上，并用等量的CEE和PbEE顆粒進行處理。值得注意的是，相比CEE處理，PbEE處理的HUVECs能夠形成更多的管狀網(wǎng)絡(luò)。一致地，傷口愈合試驗表明，CEE和PbEE均增強了HUVECs的遷移，而PbEE顯示出更優(yōu)異的功效。這些發(fā)現(xiàn)表明，PbEE在體外比CEE具有更強的促血管生成潛力。

圖2 在心肌梗死（MI）小鼠中，PbEE較CEE表現(xiàn)出更強的心臟保護作用。
（A）體內(nèi)實驗流程示意圖。使用BioRender.com繪制。ECHO：超聲心動圖。（B，C）MI后第28天的代表性超聲心動圖（B）及左心室射血分數(shù)（LVEF）和短軸縮短率（LVFS）的定量分析（C）。小鼠接受等劑量CEE或PbEE處理（3×101? particles；n=10）。（D，E）MI后第28天Masson三色染色代表性圖像及梗死面積定量分析（n=10）。比例尺：500 μm。（F，G）MI后第14天梗死邊緣區(qū)采用Ki67、pH3和Aurora B染色（紅色）評估心肌細胞增殖的代表性圖像及定量分析（n=6）。綠色：Alpha Actinin；藍色：DAPI。白色箭頭：陽性心肌細胞；方框區(qū)域：放大圖。比例尺：主圖20 μm，放大圖10 μm。（H）MI后第14天心肌細胞核型模式的代表性圖像及定量分析，包括單核心、雙核心和多核心心肌細胞比例（n=6）。比例尺：20 μm。（I）MI后第7天梗死邊緣區(qū)TUNEL陽性心肌細胞（紅色）的代表性圖像及定量分析（n=6）。方框區(qū)域：放大圖。比例尺：主圖20 μm，放大圖10 μm。（J）MI后第28天梗死邊緣區(qū)CD31陽性毛細血管（綠色）的免疫熒光染色及定量分析（n=6）。藍色：DAPI。比例尺：20 μm。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.3 PbEE對MI小鼠發(fā)揮更強的治療作用

為了評估CEE和PbEE在成年MI小鼠中的治療潛力，我們在誘導(dǎo)MI后通過心肌內(nèi)注射給予了不同劑量的這些EVs（每只動物注射30 μL生理鹽水，含$1\times10^9$、$3\times10^{10}$和$9\times10^{11}$個顆粒）。在第28天對心臟功能的評估顯示，$3\times10^{10}$個顆粒在CEE和PbEE組中誘發(fā)了最顯著的功能改善，且PbEE在所有劑量下均表現(xiàn)出比CEE更優(yōu)的療效?；诖?，$3\times10^{10}$顆粒/只被選定為進一步實驗的最佳濃度。組織學(xué)分析進一步表明，與CEE相比，PbEE治療導(dǎo)致梗死面積顯著減小。此外，PbEE治療減輕了MI誘導(dǎo)的心臟/體重比增加和CM橫截面積增大，表明PbEE對MI后的不良重塑具有更強的保護作用。

此外，免疫熒光染色顯示，與等量顆粒數(shù)的CEE相比，PbEE治療顯著增加了梗死心臟邊緣區(qū)Ki67、pH3和Aurora B陽性CMs的數(shù)量。PbEE也顯著提高了成人CMs的總數(shù)以及單核CMs的比例。在CEE或PbEE治療后，沒有觀察到對遠端區(qū)域的CM增殖有顯著影響。與體外在NMCMs中獲得的結(jié)果一致，PbEE治療顯著減少了邊緣區(qū)的凋亡CMs（相對于CEE）。此外，雖然CEE和PbEE都增強了血管生成，但PbEE表現(xiàn)出比等量CEE更大的促血管生成效果。綜合而言，這些結(jié)果表明PbEE通過促進CM增殖、抑制CM凋亡并刺激血管生成，在對抗缺血損傷方面具有更強的心肌保護作用。

圖3 miR-423-3p介導(dǎo)PbEE的心臟保護作用。
（A）Pandora測序流程示意圖。使用BioRender.com繪制。（B，C）PbEE和CEE之間差異表達小非編碼RNA（sncRNAs）的熱圖和火山圖。紅色：上調(diào)；藍色：下調(diào)（n=3）。（D）采用qRT-PCR檢測PbEE和CEE中sncRNAs的表達（n=4）。（E，F(xiàn)）采用EdU、Ki67和pH3染色評估心肌細胞增殖的代表性圖像及定量分析（n=6）。綠色：Alpha Actinin；藍色：DAPI。白色箭頭：陽性心肌細胞。比例尺：20 μm。（G，H）antagomir-miR-423-3p轉(zhuǎn)染48 h后，人胚胎干細胞（hESCs）及其來源細胞外囊泡（hESC-EVs）中miR-423-3p水平（n=6）。（I，J）低氧24 h條件下，經(jīng)PbEE、PbEE-NC或PbEE-antago-miR-423-3p（PbEE-anta）處理后心肌細胞凋亡的代表性圖像及凋亡指數(shù)（n=6）。比例尺：50 μm。（K–N）低氧心肌細胞中cleaved-Caspase 3、Bcl2和Bax的Western blot分析（n=5）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns表示無顯著差異。

3.4 PbEE通過miR-423-3p發(fā)揮心肌保護作用

眾所周知，EVs中豐富的小非編碼RNA（sncRNAs）在介導(dǎo)細胞內(nèi)活動和細胞間通訊中起著關(guān)鍵作用。為了進一步探索PbEE發(fā)揮治療作用的分子機制，我們通過PANDORA-seq分析了同等顆粒數(shù)的CEE和PbEE之間包括miRNA、piRNA、tsRNA、rsRNA和snoRNA在內(nèi)的sncRNA表達譜差異。結(jié)果顯示，與CEE相比，PbEE組中有11種sncRNAs顯著增加，7種sncRNAs顯著減少（P<0.05）。在這些上調(diào)的sncRNAs中，根據(jù)倍數(shù)變化值≥2篩選出4種高度差異表達的sncRNAs（hsa-miR-423-3p、hsa-let-7b-5p、piR-hsa-440814和hsa-miR-30d-5p）。為了驗證測序結(jié)果，我們進一步使用qRT-PCR檢測了這4種sncRNAs在兩組EVs中的表達。結(jié)果顯示，PbEE中miR-423-3p的表達顯著高于CEE。此外，我們還檢測了hESCs中miR-423-3p的表達，結(jié)果表明與未處理的hESCs相比，暴露于綠光的hESCs中miR-423-3p的水平顯著升高。因此，綠光照射能夠上調(diào)hESCs及其衍生EVs中miR-423-3p的表達。

隨后，我們檢測了在等量CEE和PbEE顆粒處理下的CMs中miR-423-3p的表達。結(jié)果顯示，與CEE組相比，PbEE處理顯著上調(diào)了CMs中miR-423-3p的表達。此前的研究表明，在多個物種中高度保守的miR-423-3p介導(dǎo)肝細胞癌和胃癌中的細胞生長。然而，miR-423-3p是否參與MI后CM增殖和心臟再生尚不清楚。為了進一步確定miR-423-3p在PbEE介導(dǎo)的心臟保護中的潛在作用，我們在綠光暴露后使用antagomir（拮抗劑）抑制hESCs中miR-423-3p的表達。qRT-PCR檢測證實了miR-423-3p在hESCs及其衍生EVs中均被有效敲減。隨后的免疫熒光顯示，與PbEE-NC組相比，PbEE-antagomir-miR-423-3p（PbEE-anta）組中EdU、pH3和ki67陽性的CMs顯著減少。這表明敲除miR-423-3p減弱了PbEE誘導(dǎo)的CM增殖。此外，抑制miR-423-3p顯著削弱了PbEE的抗凋亡作用，這反映在PbEE-anta組中TUNEL陽性CMs增加，cleaved-Caspase 3和Bax表達升高，而Bcl2水平降低。這些結(jié)果共同證明，miR-423-3p是PbEE促進CM增殖和抗凋亡的關(guān)鍵分子。

圖4 miR-423-3p通過靶向ZBTB7A/PKM2軸促進心肌細胞增殖。
（A）基于TargetScan和TarBase對miR-423-3p靶基因進行生物信息學(xué)預(yù)測。（B，C）心肌細胞經(jīng)PbEE處理或未處理48 h后的糖酵解壓力測試曲線及細胞外酸化率（ECAR）定量分析（n=4）。（D）人和小鼠ZBTB7A mRNA 3′UTR中保守miR-423-3p結(jié)合位點的序列比對，以及野生型（WT）和突變型（Mut）熒光素酶報告載體構(gòu)建示意圖。（E）HEK293T細胞共轉(zhuǎn)染miR-423-3p mimics與ZBTB7A-WT或ZBTB7A-Mut載體后的熒光素酶報告實驗（n=3）。（F，G）心肌細胞中ZBTB7A蛋白水平的Western blot分析及定量（n=4）。（H–K）EdU、Ki67和pH3陽性心肌細胞的代表性免疫熒光圖像及定量分析（n=6）。綠色：Alpha Actinin；藍色：DAPI。白色箭頭：增殖心肌細胞。比例尺：20 μm。（L，M）采用qRT-PCR和Western blot檢測PKM2在mRNA和蛋白水平的表達（n=6）。（N，O）調(diào)控miR-423-3p和ZBTB7A水平后，采用Seahorse分析心肌細胞糖酵解水平（n=3–4）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns表示無顯著差異。

3.5 綠光通過TRP-Ca2+-CAMKII-CREB信號軸上調(diào)hESCs和EVs中的miR-423-3p

此前的研究表明，綠光PBM可以通過瞬時受體電位（TRP）通道誘導(dǎo)鈣內(nèi)流，從而激活鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（CAMKII）及其下游轉(zhuǎn)錄因子cAMP響應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），進而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。為了探討綠光誘導(dǎo)hESCs及其EVs中miR-423-3p上調(diào)的上游機制，我們首先評估了其對細胞內(nèi)鈣動員的影響。Fluo-4 AM熒光檢測表明，綠光照射顯著升高了hESCs內(nèi)的鈣水平，而TRP通道抑制劑SKF消除了這種誘導(dǎo)作用。Western blot分析進一步揭示，綠光增強了CAMKII和CREB的磷酸化，這也因TRP通道抑制而受阻。接下來，我們通過qRT-PCR量化了miR-423-3p的表達。綠光暴露顯著提高了hESCs中pri-miR-423-3p和成熟miR-423-3p的水平，并相應(yīng)增加了EVs中的成熟miR-423-3p。當(dāng)TRP通道被抑制時，這些作用被逆轉(zhuǎn)，表明TRP-Ca2+通路對綠光誘導(dǎo)的miR-423-3p上調(diào)是必不可少的。

為了確定CREB是否直接調(diào)節(jié)miR-423-3p轉(zhuǎn)錄，我們對miR-423啟動子進行了熒光素酶報告基因檢測。CREB過表達顯著增強了熒光素酶活性，提示存在直接結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活。此外，hESCs中CREB敲減導(dǎo)致pri-miR-423-3p和成熟miR-423-3p顯著減少，證實了其調(diào)節(jié)作用?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明，綠光激活TRP-Ca2+-CAMKII-CREB軸以促進hESCs中miR-423-3p轉(zhuǎn)錄，從而增加EVs中miR-423-3p的豐度。

圖5 miR-423-3p通過上調(diào)PKM2抑制心肌細胞凋亡。
（A，B）在有或無miR-423-3p過表達條件下，低氧24 h后心肌細胞TUNEL染色代表性圖像及凋亡心肌細胞定量分析（n=6）。比例尺：50 μm。（C，D）miR-423-3p過表達后，低氧心肌細胞中cleaved-Caspase 3、Bcl2和Bax蛋白水平的Western blot分析（n=4–5）。（E）心肌細胞共轉(zhuǎn)染agomir-miR-423-3p與ZBTB7A過表達載體或PKM2 siRNA后的JC-1熒光代表性圖像。紅色：聚合體；綠色：單體。比例尺：25 μm。（F）JC-1聚合體/單體熒光強度比值的定量分析（n=6）。（G，H）心肌細胞內(nèi)活性氧（ROS，綠色）的代表性圖像及定量分析（n=6）。比例尺：25 μm。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.6 MiR-423-3p通過靶向ZBTB7A/PKM2軸調(diào)節(jié)心肌細胞周期激活、心肌細胞凋亡和血管生成

為了進一步研究miR-423-3p促進CM細胞周期激活的分子機制，我們使用TargetScan和TarBase算法進行生物信息學(xué)分析，以識別具有miR-423-3p保守結(jié)合位點的靶基因。在匹配兩個數(shù)據(jù)庫中的推斷靶標(biāo)后，我們發(fā)現(xiàn)Zbtb7a、Rap2c、Pabpc1和Kctd2被兩種方法共同篩選出來。目前公認，促進代謝向糖酵解的轉(zhuǎn)化可以逆轉(zhuǎn)CM細胞周期停滯。在我們的研究中，通過海馬糖酵解壓力測試（Seahorse assay）評估，發(fā)現(xiàn)PbEE處理后CM糖酵解能力顯著增強。已有研究表明，ZBTB7A（POZ/BTB和POK轉(zhuǎn)錄因子家族成員）直接結(jié)合并抑制關(guān)鍵糖酵解基因（包括丙酮酸激酶M2，Pkm2）的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)腫瘤進展。然而，ZBTB7A是否能介導(dǎo)CMs中的糖酵解代謝和MI后的心臟修復(fù)尚不清楚。因此，我們推測PbEE中的miR-423-3p可能通過下調(diào)ZBTB7A表達來促進CM糖酵解代謝，從而使CM能夠重新進入細胞周期。

為了證實這一假設(shè)，我們首先分別構(gòu)建了攜帶ZBTB7A mRNA 3'UTR結(jié)合位點或突變位點的熒光素酶報告載體。當(dāng)與miR-423-3p共轉(zhuǎn)染時，野生型ZBTB7A mRNA 3'UTR的熒光素酶活性被抑制，而當(dāng)3'UTR結(jié)合序列突變時則沒有出現(xiàn)活性的降低，這表明miR-423-3p可以直接靶向ZBTB7A的3'UTR。然后，為了驗證miR-423-3p與ZBTB7A之間的關(guān)系，我們調(diào)節(jié)了CMs中miR-423-3p的表達，發(fā)現(xiàn)過表達miR-423-3p降低了ZBTB7A蛋白水平，而抑制miR-423-3p則增加了ZBTB7A蛋白的表達。這些結(jié)果證明miR-423-3p在CMs中直接靶向并負向調(diào)節(jié)ZBTB7A的表達。此外，我們檢驗了ZBTB7A是否能調(diào)節(jié)miR-423-3p在CM增殖中的調(diào)控作用。免疫熒光染色顯示，ZBTB7A的過表達抑制了由miR-423-3p誘導(dǎo)的EdU、Ki67和pH3陽性CM的增加。

隨后，我們進一步研究了miR-423-3p是否通過ZBTB7A影響PKM2表達，從而促進CMs中的糖酵解。結(jié)果顯示，過表達miR-423-3p顯著上調(diào)了PKM2的mRNA和蛋白質(zhì)表達，但ZBTB7A的強制表達逆轉(zhuǎn)了miR-423-3p的促進作用。同時，我們進行了海馬糖酵解壓力測試來評估m(xù)iR-423-3p和ZBTB7A在CM代謝中的作用。結(jié)果顯示，強制表達miR-423-3p增強了CMs的糖酵解能力，而同時過表達ZBTB7A則逆轉(zhuǎn)了miR-423-3p的糖酵解促進作用?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明miR-423-3p抑制ZBTB7A表達，從而促進Pkm2轉(zhuǎn)錄，由此提升CMs中的糖酵解代謝并最終解除CM細胞周期的阻滯。

此外，我們發(fā)現(xiàn)，如TUNEL陽性CMs減少、cleaved-Caspase 3和Bax水平降低以及Bcl2表達上調(diào)所示，過表達CMs中的miR-423-3p顯著抑制了缺氧誘導(dǎo)的CM凋亡。眾所周知，PKM2不僅是需氧糖酵解的促進劑，也是線粒體穩(wěn)態(tài)和細胞存活的調(diào)節(jié)劑。在本研究中，JC-1檢測顯示，由缺氧引起的CM線粒體膜電位下降由于miR-423-3p的過表達而得到顯著的保持。然而，miR-423-3p對線粒體膜電位的穩(wěn)定作用卻被過表達ZBTB7A或敲低PKM2所抑制。此外，線粒體活性氧（ROS）的產(chǎn)生在ago-miR-423-3p組中顯著減少，而在CM中過表達ZBTB7A或敲低PKM2則能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。此外，與CEE組相比，在PbEE處理的HUVECs中，我們也發(fā)現(xiàn)miR-423-3p和PKM2的表達顯著增加，同時ZBTB7A的水平有所降低?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明miR-423-3p通過靶向PKM2維持CM線粒體功能、抑制細胞凋亡并促進血管生成。

為了進一步驗證miR-423-3p在MI后心臟修復(fù)中的作用，我們在小鼠MI模型中通過尾靜脈注射給予了agomir-miR-423-3p。接受agomir-miR-423-3p的小鼠表現(xiàn)出顯著改善的心臟功能和縮小的梗死面積。此外，agomir-miR-423-3p組的Ki67和pH3陽性CM數(shù)量明顯增加。agomir-miR-423-3p組的TUNEL陽性CM數(shù)量也相應(yīng)減少。qRT-PCR分析證實，全身注射agomir導(dǎo)致心臟組織中miR-423-3p顯著過表達。另外，過表達miR-423-3p下調(diào)了ZBTB7A的表達，同時上調(diào)了心臟組織和成人CM中PKM2的表達。上述發(fā)現(xiàn)表明，過表達miR-423-3p可通過促進CM存活顯著改善MI后的心臟功能。

圖6 甲基丙烯酰化明膠（GelMA）微針（MN）貼片的制備與表征。
（A）GelMA微針制備流程示意圖。（B）完整微針貼片的宏觀數(shù)字圖像（左）及單個微針的放大圖（右）。比例尺：左圖1 mm，右圖200 μm。（C）不同放大倍數(shù)下顯示微針形貌的代表性掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。（D）壓縮測試中微針貼片的力學(xué)性能表征（應(yīng)力-應(yīng)變曲線）。比例尺：200 μm。（E，F(xiàn)）裝載Tracker探針標(biāo)記PbEE（紅色）的微針貼片的光學(xué)和熒光顯微鏡圖像。（G）采用納米顆粒追蹤分析（NTA）定量檢測PbEE從微針貼片中隨時間釋放的累積釋放曲線（n=3）。（H）微針貼片與低氧心肌細胞共培養(yǎng)體系示意圖。使用BioRender.com繪制。（I，J）低氧3天并分別與單獨MN、游離PbEE或PbEE裝載微針（PbEE@MN）共孵育后，心肌細胞TUNEL染色代表性圖像及凋亡心肌細胞定量分析（n=6）。藍色：DAPI。比例尺：50 μm。（K–M）處理7天后Ki67和pH3陽性心肌細胞的代表性免疫熒光圖像及定量分析（n=6）。白色箭頭：陽性增殖信號。比例尺：20 μm。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。**P<0.01，***P<0.001。

3.7 ZBTB7A的過表達消除了PbEE在體內(nèi)的心肌保護作用

為了進一步探究ZBTB7A在PbEE心肌保護作用中的角色，我們使用重組AAV9系統(tǒng)在接受PbEE治療的MI小鼠中誘導(dǎo)了心臟特異性的ZBTB7A過表達。不出所料，過表達ZBTB7A（MI+PbEE+AAV9-ZBTB7A）極大地抵消了PbEE對心臟收縮力的治療益處（如EF%和FS%相對于MI+PbEE+AAV9-NC組降低所證明的）。一致地，由PbEE誘導(dǎo)的梗死面積減小也被ZBTB7A的過表達所逆轉(zhuǎn)。此外，心臟組織的免疫熒光染色顯示，與MI+PbEE+AAV9-NC組相比，過表達ZBTB7A顯著減少了Ki67陽性CM的數(shù)量，增加了TUNEL陽性CM的比例，并降低了CD31的信號強度。Western blot分析顯示PbEE處理下調(diào)了ZBTB7A并上調(diào)了PKM2，而ZBTB7A的強制表達有效阻斷了PbEE誘導(dǎo)的PKM2上調(diào)。這些結(jié)果表明，ZBTB7A的過表達消除了PbEE的心肌保護作用。

圖7 PbEE@MN促進人胚胎干細胞來源心肌細胞（hESC-CMs）增殖并抑制其凋亡。
（A）hESC-CM分化流程示意圖。使用BioRender.com繪制。（B）PbEE@MN與hESC-CMs共培養(yǎng)實驗設(shè)計示意圖。（C，D）低氧3天后，經(jīng)單獨MN、CEE、PbEE或PbEE@MN處理的hESC-CMs中TUNEL染色代表性圖像及凋亡細胞定量分析（n=6）。藍色：DAPI。比例尺：20 μm。（E，F(xiàn)）共培養(yǎng)7天后Ki67?和pH3? hESC-CMs的代表性免疫熒光圖像及定量分析（n=6）。白色箭頭：陽性增殖信號。比例尺：20 μm。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.8 負載PbEE的GelMA微針貼片的表征

盡管EVs具有治療前景，但其快速清除和靶部位的滯留性差阻礙了其臨床轉(zhuǎn)化。為了實現(xiàn)PbEE向梗死心肌的局部持續(xù)遞送，我們通過兩步模板法制備了甲基丙烯酰明膠（GelMA）微針（MN）貼片。光學(xué)顯微鏡顯示微針尖端呈圓錐形并排列成精確的陣列。該貼片由68根獨立的針組成，均勻分布在直徑為0.6 cm的圓形底板上。SEM顯示每根針尖平坦且完整，長度約為650 μm，基部直徑為320 μm。隨后我們評估了決定MN穿透心肌能力的機械性能，結(jié)果顯示單根針的機械強度為0.4 N，據(jù)報道這足以在不斷裂的情況下穿透心肌。為了可視化EV在水凝膠基質(zhì)中的分布，我們將熒光標(biāo)記的PbEE摻入MN貼片中。光學(xué)和熒光顯微鏡圖像都證實了EVs均勻分布在整個MN結(jié)構(gòu)中。隨后進行了體外釋放研究以表征EVs的釋放動力學(xué)。在多個時間點通過NTA對釋放的EV顆粒的累積數(shù)量進行量化。釋放曲線顯示前三天內(nèi)呈現(xiàn)初始突釋，隨后進入了較長時期的持續(xù)釋放階段。這些結(jié)果表明，MN貼片能夠在延長的時間段內(nèi)持續(xù)遞送PbEE。

治療用MN應(yīng)用中一個關(guān)鍵的考量是其制造過程是否會損害EV的完整性和生物活性。為了解決這個問題，我們比較了從溶解的MN中回收的PbEE（MN-PbEE）與天然未經(jīng)處理的PbEE（NA-PbEE）。Zeta電位分析顯示MN-PbEE和NA-PbEE之間的表面電荷沒有顯著差異，這暗示其膜穩(wěn)定性得以保持。TEM進一步證實MN-PbEE維持了其典型的杯狀形態(tài)。為了評估囊泡內(nèi)裝載物的完整性，我們定量了PbEE中關(guān)鍵功能miRNA（miR-423-3p）的表達水平，結(jié)果未觀察到MN-PbEE和NA-PbEE之間存在顯著差異。然后我們在體外評估了MN-PbEE的細胞攝取和功能表現(xiàn)。攝取檢測顯示，MN-PbEE被CM內(nèi)化的效率與NA-PbEE相當(dāng)。在功能上，MN-PbEE能顯著增強CM增殖并抑制凋亡，其程度與NA-PbEE相似。此外，兩組EVs之間的促血管生成能力也沒有顯著差異。這些結(jié)果證明在MN制造后，PbEE的生物活性得到了保持。

接下來我們評估了與傳統(tǒng)的直接孵育相比，MN介導(dǎo)的遞送是否能進一步增強PbEE的治療效能。我們通過直接孵育或MN介導(dǎo)遞送用PbEE處理原代CMs 3-7天。后續(xù)分析顯示，與直接PbEE孵育相比，負載在MNs中的PbEE（PbEE@MN）對CM凋亡表現(xiàn)出更顯著的抑制作用。一致地，相對于直接的PbEE處理，PbEE@MN進一步增加了Ki67和pH3陽性CM的比例，表明對CM增殖的促進作用增強。為了進一步評估PbEE的臨床轉(zhuǎn)化潛力，我們將研究擴展至人類胚胎干細胞衍生的心肌細胞（hESC-CMs）。與原代NMCMs一致，PbEE在hESC-CMs中表現(xiàn)出比CEE更強的抗凋亡和細胞周期激活活性。重要的是，PbEE@MN的治療功效優(yōu)于游離的PbEE。上述發(fā)現(xiàn)表明，封裝在MN內(nèi)的PbEE表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，并對CM凋亡和細胞周期激活發(fā)揮持續(xù)的有益作用。

圖8 GelMA微針貼片延長PbEE滯留時間并增強其在MI中的治療效果。
（A）體內(nèi)研究設(shè)計示意圖。使用BioRender.com繪制。（B）將PbEE裝載微針貼片應(yīng)用于MI心臟的宏觀圖像。圖III和圖IV分別表示貼附后5 min和10 min的狀態(tài)。（C）植入后第3天微針貼片穩(wěn)定附著于心臟表面。比例尺：1 mm。（D）H&E染色顯示微針穿透心肌組織的代表性圖像。比例尺：500 μm。（E）微針處理后第28天心臟宏觀圖像。比例尺：1 mm。（F）微針處理后第28天心臟Masson三色染色代表性圖像。比例尺：500 μm。（G）采用H&E染色檢測微針處理組心臟是否存在異常炎癥浸潤或結(jié)構(gòu)改變。比例尺：50 μm。（H）采用qRT-PCR分析炎癥因子Tnfa、Il1b和Il6的mRNA表達（n=3）。（I）MI后第0、3和14天采用生物發(fā)光成像（BLI）追蹤心臟中EVs的分布（n=4）。（J）PbEE或PbEE@MN處理后第28天代表性M型超聲心動圖。（K）第28天梗死區(qū)域Masson三色染色代表性圖像。比例尺：500 μm。（L，M）左心室射血分數(shù)（LVEF）和短軸縮短率（LVFS）的定量分析（n=10）。（N）梗死面積定量分析（n=10）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns表示無顯著差異。

3.9 PbEE@MN對MI小鼠的治療作用

基于體外研究證實MNs可以有效加載和釋放PbEE，我們進一步評估了PbEE@MN（負載了$3\times10^{10}$個PbEE顆粒）在成年小鼠MI模型中的治療潛力。將MN貼片放置在連接到真空的泵頭裝置上，通過將該裝置保持在梗死心臟上5秒，MN針尖完全插入心肌而沒有脫落。H&E染色顯示出MN針尖穿透心肌組織的針孔。為了評估MN貼片在體內(nèi)的降解情況，我們在植入后第3、7和14天獲取了心臟表面貼片的圖像。圖像顯示結(jié)構(gòu)完整性呈現(xiàn)時間依賴性降低，到第14天時貼片幾乎檢測不到。這一觀察通過Masson三色染色得到進一步驗證，證實了MN貼片具有可生物降解的性質(zhì)。為了評估MNs的心臟安全性，將空MN穿透的心臟組織與正常心臟組織（Ctl）進行了比較。H&E染色顯示MN處理的心臟沒有異常的炎癥浸潤或結(jié)構(gòu)改變。qRT-PCR進一步證實MN處理組和Ctl組之間炎癥因子Tnfa、Il1b和Il6的表達沒有顯著差異，表明MNs具有良好的生物相容性。為了測定PbEE在小鼠心肌中的保留率，我們利用Tracker探針標(biāo)記的EVs來觀察心肌內(nèi)注射PbEE和PbEE@MN處理后不同時間段心臟中的熒光信號。在第3天，PbEE@MN組的EV熒光強度顯著高于PbEE組。在第14天，注射PbEE的心臟中信號不再存在，但在使用PbEE@MN處理的心臟中信號仍然明顯。這些結(jié)果表明，制備的MN貼片能夠持續(xù)有效地將PbEE遞送至心肌缺血區(qū)域。

隨后，我們評估了PbEE@MN對梗死心臟的治療效果。結(jié)果表明，接受PbEE@MN治療（負載了$3\times10^{10}$個PbEE顆粒）的動物表現(xiàn)出比接受PbEE心肌內(nèi)注射的動物在心臟功能、心/體重比、梗死面積和CM橫截面積方面更顯著的改善。免疫熒光染色和體視學(xué)分析表明，與注射PbEE的組相比，PbEE@MN組的Ki67、pH3和Aurora B陽性CM數(shù)量、單核CM比例以及CM總數(shù)顯著增加。此外，TUNEL分析顯示，PbEE@MN發(fā)揮的抗凋亡作用比直接注射PbEE更強（體現(xiàn)為凋亡CM的顯著減少）。同時，與注射PbEE組相比，PbEE@MN進一步促進了梗死心臟的血管生成。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，MN貼片確實通過長時間持續(xù)釋放EVs提高了PbEE的治療效果。

為了進一步確認miR-423-3p/ZBTB7A/PKM2軸在PbEE@MN介導(dǎo)的心肌保護中的關(guān)鍵作用，我們檢測了PbEE和PbEE@MN治療后MI心臟中ZBTB7A和PKM2的表達。結(jié)果顯示，PbEE@MN顯著抑制了心臟組織中ZBTB7A的表達并上調(diào)了PKM2的蛋白水平。然后，將敲低miR-423-3p的PbEE加載到MNs中（PbEE-anta@MN）并評估其對心臟修復(fù)的影響。我們發(fā)現(xiàn)沉默miR-423-3p部分消除了PbEE@MN對心肌損傷的保護作用。這些發(fā)現(xiàn)表明miR-423-3p是PbEE@MN介導(dǎo)心肌保護的關(guān)鍵分子。

圖9 通過微針貼片遞送PbEE促進心臟恢復(fù)并表現(xiàn)出良好生物相容性。
（A）MI后第28天心臟重量/體重比（n=6）。（B）麥胚凝集素（WGA）染色（綠色）代表性圖像及心肌細胞橫截面積定量分析（n=6）。比例尺：20 μm。（C）分離心肌細胞的代表性圖像及定量分析（n=6）。比例尺：100 μm。（D）MI后第14天心肌細胞核型模式的代表性圖像及定量分析，包括單核心、雙核心和多核心心肌細胞占總心肌細胞的比例（n=6）。比例尺：20 μm。（E）MI后第14天梗死邊緣區(qū)Ki67?、pH3?和Aurora B?心肌細胞的代表性免疫熒光圖像及定量分析（n=6）。白色箭頭：陽性心肌細胞；方框區(qū)域：放大圖。比例尺：主圖20 μm，放大圖10 μm。（F）MI后第7天梗死邊緣區(qū)凋亡心肌細胞的TUNEL染色（紅色）代表性圖像及定量分析（n=6）。比例尺：主圖20 μm，放大圖10 μm。（G）MI后第28天梗死邊緣區(qū)CD31免疫熒光染色（綠色）及毛細血管密度定量分析（n=6）。比例尺：20 μm。（H，I）梗死邊緣區(qū)ZBTB7A和PKM2蛋白水平的Western blot分析（n=4）。（J）PbEE@MN處理后6、8和10周小鼠心臟H&E染色代表性圖像。比例尺：50 μm。（K）MI小鼠經(jīng)PbEE@MN處理后，心臟中Desmin、Vimentin和Calb2的qRT-PCR分析（n=4）。（L）微針釋放后第14天收集殘留EVs，并采用納米顆粒追蹤分析（NTA）進行定量（n=4）。（M）處理后第28天主要器官（肝、脾、腎、腦、肺）的H&E染色代表性圖像（n=3）。比例尺：200 μm。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.10 安全性評估

鑒于EVs中某些miRNAs可能存在致瘤風(fēng)險，從而可能危及療效，我們進一步評估了基于PbEE療法的安全性情況。通過H&E染色進行的組織學(xué)檢查顯示，用PbEE@MN治療6、8和10周后，心臟組織均未出現(xiàn)形態(tài)學(xué)異常。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，對已確立的心臟腫瘤標(biāo)志物（包括Desmin、Vimentin和Calb2）進行qRT-PCR分析顯示，與對照組相比并未見顯著上調(diào)，這表明在10周的治療期內(nèi)不存在致瘤活性。此外，體外釋放研究表明，系統(tǒng)中的幾乎所有EVs在14天后均被釋放，表明長期滯留風(fēng)險極低。此外，對肝臟、脾臟、腎臟、大腦和肺組織的H&E染色顯示沒有顯著的細胞死亡或炎癥浸潤，這也為多器官安全性提供了支持。綜合而言，這些結(jié)果表明，負載PbEE的GelMA微針貼片代表了一種增強MI后心臟再生和修復(fù)的安全有效策略。

【Citation】:Liu Y, Li S, Cai A, et al. Photobiomodulation-reprogrammed extracellular vesicles delivered via a biodegradable microneedle patch promote cardiac repair by enhancing glycolytic metabolism.Acta Pharmaceutica Sinica B.2026.

【貢獻】★★★★★

總之，本研究系統(tǒng)地表征了PbEE的心肌保護特性，這是一種在綠光照射下由hESCs衍生出的新型EVs。我們的研究結(jié)果表明，與天然EVs相比，PbEE對心肌缺血性損傷表現(xiàn)出更優(yōu)越的保護功效。在機制上，PbEE向心肌細胞（CMs）遞送了豐富的miR-423-3p，隨后通過miR-423-3p/ZBTB7A/PKM2軸增強糖酵解通量，最終促進心肌細胞增殖并抑制細胞凋亡。此外，我們將PbEE封裝到基于GelMA的微針（MN）貼片中，建立了一個穩(wěn)定的EV遞送系統(tǒng)。與直接心肌內(nèi)注射相比，負載PbEE的微針貼片實現(xiàn)了EV的持續(xù)釋放，并對心肌梗死（MI）發(fā)揮了卓越的治療效果。

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