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揭秘研究背后的故事

作者丨XQ

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種高度異質性、慢性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其特征是循環(huán)自身抗體和影響多個組織和器官的炎癥反應。由于臨床表現(xiàn)的異質性、不可預測的病程和發(fā)作，SLE的臨床診斷和治療極具挑戰(zhàn)。SLE的發(fā)病至今尚未完全明確，主要依據(jù)臨床癥狀和實驗室檢查權重來進行診斷，理清其發(fā)病機制有助于提高疾病臨床診療效率，對減輕患者疾病負擔至關重要。

近日，海軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院（上海長征醫(yī)院）風濕免疫科徐滬濟教授團隊發(fā)表在Ann Rheum Dis上的一則研究結果[1]證明，白細胞介素4（IL-4）通過驅動自身反應性B細胞的無能逆轉，從而促進SLE發(fā)病。此外，研究還建立了通過阻斷IL-4信號傳導來治療SLE的科學理論，或為SLE的臨床診斷和新藥研發(fā)提供新靶點（圖1）。

圖1：研究發(fā)表于Ann Rheum Dis

無能B細胞為SLE關鍵病因，

探索其具體致病機制或成疾病減負關鍵

SLE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是自身反應性B細胞激活，生成大量針對細胞核、細胞漿以及其他細胞成分的自身免疫性抗體。在B細胞發(fā)育過程中，V(D)J基因通過隨機重組產生B細胞受體（BCRs）。據(jù)估計，50%~70%自發(fā)產生的B細胞可能產生識別自身抗原的抗體，因此抑制自身反應性B細胞克隆以避免自身免疫對人體的免疫平衡至關重要。

中樞免疫耐受通過受體編輯或克隆清除約50％的自身反應性B細胞，其余進入循環(huán)的自身反應性B細胞被外周耐受性通過誘導無能抑制。

無能B細胞（BND）是存于外周循環(huán)系統(tǒng)中通過克隆無能機制達到免疫耐受狀態(tài)的具有自身反應性的一群B淋巴細胞，具有發(fā)展成為致病性自身反應性B細胞的潛能，目前公認，BND細胞是在人體內表面標記為低至陰性的IgM表達的na?ve B細胞（CD19+CD27-IgD+IgM-/low）。

BND可降低細胞表面的BCRs密度，并減弱BCRs激活后的信號，從而限制細胞分化、增殖和自身反應性抗體的產生。在病理條件下，BND的無能狀態(tài)可以被逆轉，進而促進自身免疫。近幾年的研究更是發(fā)現(xiàn)，SLE產生自身反應性抗體的漿細胞來源于激活的BND。此外，通過評估SLE中異常上調的細胞因子，發(fā)現(xiàn)IL-4是恢復信號傳導的最重要體液成分，小鼠研究亦顯示IL-4可逆轉B細胞無能。

基于此，為探究BND參與SLE發(fā)病的機制、證實IL-4在SLE發(fā)病機制中的作用，研究團隊展開了本次研究。

IL-4通過驅動BND的減少和破壞，

促進SLE發(fā)病

本次研究血液樣本主要來自于SLE患者和健康對照者，扁桃體取自接受扁桃體切除術的扁桃體炎患者。其中，所有SLE患者均符合美國風濕病學會1997年修訂的SLE標準。

為了分析人外周 血中的 B ND 細胞，研究團隊首先在整個研究中使用了門控策略。傳統(tǒng)的 na?ve B細胞（CNBs）表達IgD和IgM（CD19 + CD27 - IgD + IgM + ）（圖 1A），而B ND 細胞表達 IgD但很少或不表達IgM。通過比較SLE患者和健康對照組的B ND 數(shù)量，發(fā)現(xiàn)SLE患者BND細胞占總B細胞或na?ve B細胞的百分比較健康對照者明顯降低（圖 2） 。

圖2：BND細胞在總B細胞或na?ve B細胞中的百分比

此外，BND水平與SLE疾病活動指數(shù)（r=?0.40，p=0.011）及血清抗dsDNA自身抗體水平（r=?0.40，p=0.03）呈負相關，且在患者接受有效治療（糖皮質激素治療1 ~ 1.5mg/kg）后可恢復。同時，SLE患者和健康對照者之間的B細胞、CNB和記憶B細胞數(shù)量無顯著差異（p＞0.05）。探究SLE患者BND的功能狀態(tài)時發(fā)現(xiàn)，SLE患者和健康對照者在CNB中IgD的表達沒有顯著差異，但標志著較低無能狀態(tài)的表面IgM（sIgM）在SLE患者中顯著上調。

也就是說，相比健康對照組，SLE組患者BND數(shù)量明顯減少，且無能性減弱。

隨后，研究團隊對SLE患者和健康對照者BND和CNB之間的差異表達基因（DEGs）進行了RNA-seq分析并根據(jù)基因本體聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫將DEGs分為不同的功能類別，對SLE患者和健康對照者BND和CNB進行了BCR譜測序，對BND、CNB細胞、記憶B細胞和抗體分泌細胞（ASC）之間BCR譜數(shù)據(jù)進行了連接分析。結果發(fā)現(xiàn)，SLE患者BND與其他B細胞亞群的溝通增加，并有一定的轉化可能，這可能導致BND數(shù)量減少。

進一步測定SLE患者和健康對照者BND和CNB上各種細胞因子受體的表達發(fā)現(xiàn)，IL-4R和IL-13RA1在BND人群中特征性地上調。此外，在SLE患者和健康對照者的BND細胞中，IL-4R和IL-13RA1有差異表達。這意味著，IL-4/IL-4R和/或IL-13/IL-13R通路可能有助于B細胞無能的維持。

通過孵育健康對照者外周血單個核細胞（PBMC）與健康對照者或SLE患者血漿，研究團隊發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿顯著降低了BND細胞的百分比，且SLE患者血漿中IL-4、IL-6、IL-10和干擾素γ（IFN-γ）等細胞因子的水平比健康對照者顯著升高（圖3）。為了確定血漿中每種細胞因子的效應，研究團隊測試了不同細胞因子孵育對PBMC的影響，發(fā)現(xiàn)IL-4和IL-13在下調BND百分比和上調sIgM方面最為顯著。此外，SLE血漿中只有IL-4阻斷，而沒有IL-13阻斷，但足以逆轉sIgM。因此，IL-4可能在調節(jié)SLE患者BND細胞的病理改變中發(fā)揮重要作用，阻斷血漿中的IL-4可能充分逆轉疾病表型。

為研究IL-4逆轉B細胞無能的分子基礎，研究團隊使用TotalSeq-C抗體標記技術進行單細胞分析，比較SLE患者和健康對照者在IL-4誘導前后各B細胞亞群的差異。結果發(fā)現(xiàn)，經IL-4刺激的健康對照者BND細胞，可觀察到JUN、EZR、IRF8、HLA-DQB1、CXCR4、HLA-DOA、HLA-A、HLA-B和HLA-C的轉錄變化，這與在SLE患者BND細胞中觀察到的模式相似。這證實了，IL-4刺激健康對照者BND會誘導轉錄變化，進而導致SLE發(fā)病。

深入研究發(fā)現(xiàn)，BND細胞中sIgM的下調主要是受受體內化而非轉錄下調調控，IL-4可能通過破壞受體介導的內吞過程，可能導致sIgM上調，進而打破BND耐受。研究團隊進一步從mRNA和蛋白水平進行分析，證實了IL-4通過STAT6信號通路中斷sIgM的內化、促進其蛋白穩(wěn)定性，從而上調sIgM，最終逆轉B細胞的無能，促進SLE發(fā)病。

提供堅實理論基礎及診療靶點，

或可助力臨床診療效率大大提升

本次研究首次通過免疫分析、功能分析和轉錄組分析，廣泛描述了SLE患者中BND群的異常，并建立了患者血漿中IL-4病理性升高和BND無能逆轉之間的聯(lián)系。IL-4是2型輔助性T細胞（Th2）和濾泡輔助性T細胞（Tfh）分泌的關鍵因子，驅動SLE患者的無反應BND細胞的致病性再激活，這與既往研究Th2和Tfh在打破免疫耐受中作用的文獻建立了有機聯(lián)系。

既往有研究在基因敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，IL-4缺乏對狼瘡樣癥狀具有保護作用。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在SLE患者的炎癥真皮和表皮組織中，分泌IL-4的CD4+ T細胞的百分比顯著升高，而且恢復BND有助于改善SLE癥狀。

綜上所述，本次研究為使用IL-4阻斷治療SLE患者提供了堅實的科學理論基礎，此外提供了診斷和治療的生物標志物，或可助力臨床在高度異質性的SLE患者人群中識別最有可能從IL-4干預中獲益的患者。

專家簡介

徐滬濟教授

徐滬濟教授現(xiàn)任海軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院大內科主任和風濕免疫科主任，兼任清華大學醫(yī)學院教授，清華-北大生命科學中心臨床研究員。

徐滬濟教授是國之名醫(yī)-卓越成就獎獲得者，仁心醫(yī)者-上海市杰出專科醫(yī)師獎， 科技部973計劃“首席科學家”，曾榮獲個人“二等功”一次。歷任中華醫(yī)學會風濕病學分會副主任委員、中國醫(yī)師學會風濕免疫科分會副會長、上海市醫(yī)學會風濕病專科分會主任委員?，F(xiàn)任風濕病頂尖國際期刊Annals of the Rheumatic Diseases編委，International Journal of Rheumatic Diseases副主編，F(xiàn)rontiers in Immunology和Frontiers in Medicine副主編，《中國內科年鑒》主編。

徐滬濟教授39年來執(zhí)著醫(yī)學事業(yè)，以臨床實踐為基礎，開展自身免疫和感染免疫疾病研究，取得了一系列系統(tǒng)性原創(chuàng)性研究成果。相關研究成果已發(fā)表論文 242 篇，發(fā)表論文期刊包括Nature、Nature Genetics、Nature Communication、Lancet Rheumatology、The Journal of Experimental Medicine和The Proceedings of National Academy of Sciences USA等主流SCI雜志，其中11篇論文發(fā)表在風濕病頂尖雜志 Annals of the Rheumatic Diseases (IF 27.9)，5篇發(fā)表在Arthritis & Rheumatology (IF 15.4)。發(fā)表論文累積影響因子超過1300分，ESI 高引論文 5 篇，F(xiàn)1000 推薦論文3篇。研究成果以第一完成人獲得《教育部科技進步獎一等獎》《上海市科技進步獎一等獎》和《上海市醫(yī)學科技獎一等獎》各一項。

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參考資料：

[1]Liu Y, Zhang Z, Kang Z, Zhou XJ, Liu S, Guo S, Jin Q, Li T, Zhou L, Wu X, Wang YN, Lu L, He Y, Li F, Zhang H, Liu Y, Xu H. Interleukin 4-driven reversal of self-reactive B cell anergy contributes to the pathogenesis of systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 2023 Aug 11:ard-2023-224453. doi: 10.1136/ard-2023-224453. Epub ahead of print. PMID: 37567607.

本文審核丨徐滬濟教授 責任編輯丨芋子

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