2026年5月16日，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)劉永琦團(tuán)隊、靳曉杰團(tuán)隊、張志明團(tuán)隊等，聯(lián)合蘇州大學(xué)、甘肅省中醫(yī)院等單位，在Phytomedicine（JIF 顯示為 8.3，JCR Q1）在線發(fā)表題為 “Qingfei Tongluo Formula attenuates COPD-associated ferroptosis by restoring arachidonic acid metabolic balance via dual inhibition of prostaglandin-endoperoxide synthase 2 and soluble epoxide hydrolase 2” 的研究論文。該文于 2026年1月21日投稿，2026年5月9日修回，2026年5月13日接收，2026年5月16日在線發(fā)表。

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是全球重要慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，現(xiàn)有治療主要以支氣管擴(kuò)張劑、吸入糖皮質(zhì)激素等對癥干預(yù)為主，仍難以阻止疾病進(jìn)展或逆轉(zhuǎn)肺組織損傷。炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和鐵死亡被認(rèn)為是COPD持續(xù)進(jìn)展中的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，而花生四烯酸（AA）代謝失衡可進(jìn)一步放大脂質(zhì)過氧化、炎癥損傷和鐵死亡。該研究聚焦中藥復(fù)方清肺通絡(luò)方（QFTLF），試圖回答其改善COPD的核心分子機(jī)制及關(guān)鍵入血活性成分。

研究團(tuán)隊構(gòu)建了COPD大鼠模型，并結(jié)合UPLC-MS/MS血清藥物化學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、PS-V2N復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析、單細(xì)胞RNA測序、計算機(jī)輔助藥物設(shè)計（CADD）、分子動力學(xué)模擬、SPR驗證以及體內(nèi)外實驗，系統(tǒng)解析清肺通絡(luò)方的多靶點作用機(jī)制。結(jié)果顯示，清肺通絡(luò)方可顯著改善COPD大鼠肺功能、肺組織病理損傷和系統(tǒng)性炎癥，其藥效與經(jīng)典治療藥物氨茶堿相當(dāng)；同時，UPLC-MS/MS共鑒定出58個原型入血成分。

機(jī)制上，清肺通絡(luò)方能夠下調(diào)前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2/COX-2）和可溶性環(huán)氧化物水解酶2（EPHX2/sEH），并上調(diào)CYP2J2，從而恢復(fù)花生四烯酸代謝平衡。具體表現(xiàn)為抗炎、抗氧化代謝物11,12-EET升高，而促炎、促氧化代謝物11,12-DHET下降。隨之，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子降低，MDA、Fe2?積累、HMGB1釋放和GPX4下調(diào)等脂質(zhì)過氧化及鐵死亡相關(guān)指標(biāo)得到改善。

進(jìn)一步的單細(xì)胞與組織驗證提示，PTGS2和EPHX2主要在ProSPC陽性的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AT2 cells）中表達(dá)升高，而清肺通絡(luò)方干預(yù)后這一變化明顯減弱，說明AT2細(xì)胞可能是清肺通絡(luò)方調(diào)控COPD相關(guān)鐵死亡和炎癥損傷的重要細(xì)胞群。研究還發(fā)現(xiàn)，PTGS2和EPHX2特異性抑制劑在CSE誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞損傷模型中呈現(xiàn)出與清肺通絡(luò)方相似的保護(hù)作用，進(jìn)一步支持PTGS2/EPHX2雙靶點調(diào)控在該機(jī)制中的關(guān)鍵地位。

在活性物質(zhì)基礎(chǔ)方面，研究通過CADD和SPR驗證篩選出7個與靶點具有較高結(jié)合親和力的關(guān)鍵入血成分。其中，牡丹苷C、黃芩苷、牡荊素、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷與PTGS2結(jié)合較強(qiáng)；金縷梅鞣質(zhì)、Choerospondin、牡荊素、Nepitrin、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷與EPHX2結(jié)合較強(qiáng)。尤其是牡荊素和蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷顯示出作為PTGS2/EPHX2雙靶點候選成分的潛力。

總體來看，該研究提出清肺通絡(luò)方可能是一類天然來源的PTGS2/EPHX2雙重抑制干預(yù)方案，通過重塑花生四烯酸代謝平衡，減輕COPD肺上皮細(xì)胞相關(guān)鐵死亡、炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化，為中藥復(fù)方干預(yù)COPD進(jìn)展提供了多組學(xué)和實驗驗證依據(jù)。但需要注意的是，研究證據(jù)主要來自動物模型、細(xì)胞模型和計算/結(jié)合實驗，不能直接等同于人體臨床療效。

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【摘要】

背景：慢性阻塞性肺疾?。–OPD）仍是全球重要健康挑戰(zhàn)，主要原因在于目前缺乏能夠改變疾病進(jìn)展的治療手段。清肺通絡(luò)方（QFTLF）是一種經(jīng)典中藥復(fù)方，已在COPD中顯示出一定療效，但其具體分子機(jī)制和活性成分尚不明確。

目的：本研究旨在解析清肺通絡(luò)方抗COPD的多靶點作用機(jī)制，并系統(tǒng)鑒定其關(guān)鍵入血活性成分。

方法：研究首先在COPD大鼠模型中進(jìn)行藥效學(xué)評價，并基于UPLC-MS/MS鑒定清肺通絡(luò)方原型入血成分。在此基礎(chǔ)上，研究整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基于PS-V2N的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析和單細(xì)胞RNA測序，識別原型入血成分調(diào)控的核心靶點、通路和細(xì)胞類型。關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步通過體內(nèi)和體外實驗驗證。為鑒定關(guān)鍵入血活性成分，研究采用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計（CADD）流程，包括誘導(dǎo)契合分子對接、分子動力學(xué)模擬和結(jié)合自由能計算，并通過表面等離子體共振（SPR）進(jìn)行實驗確認(rèn)。

結(jié)果：藥效學(xué)評價顯示，清肺通絡(luò)方顯著改善COPD大鼠肺功能、肺組織病理改變和系統(tǒng)性炎癥，其療效與經(jīng)典治療藥物氨茶堿相當(dāng)。UPLC-MS/MS共鑒定出58個原型入血成分。多模態(tài)分析及實驗驗證表明，清肺通絡(luò)方在COPD大鼠肺組織和CSE誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中均可下調(diào)前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）和可溶性環(huán)氧化物水解酶2（EPHX2），同時上調(diào)CYP2J2。該調(diào)控作用恢復(fù)了花生四烯酸代謝平衡，使抗炎、抗氧化代謝物11,12-EET升高，促炎、促氧化代謝物11,12-DHET下降。由此，清肺通絡(luò)方抑制了下游病理指標(biāo)，包括促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，脂質(zhì)過氧化指標(biāo)GSH和T-SOD降低、MDA升高，以及鐵死亡指標(biāo)Fe2?積累、HMGB1釋放和GPX4下調(diào)。該作用與抑制PTGS2–PPARγ–CYP2J2通路和EPHX2介導(dǎo)通路有關(guān)。值得注意的是，PTGS2和EPHX2特異性抑制劑在CSE誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中的保護(hù)效應(yīng)與清肺通絡(luò)方高度相似，進(jìn)一步支持這些靶點參與其中。此外，CADD和SPR鑒定并驗證了7個具有較高結(jié)合親和力的關(guān)鍵入血成分：其中4個靶向PTGS2，包括Mudanpioside C、Baicalin、Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside；5個靶向EPHX2，包括Hamamelitannin、Choerospondin、Vitexin、Nepitrin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside。

結(jié)論：本研究表明，清肺通絡(luò)方是一種天然來源的PTGS2/EPHX2雙重抑制劑，可通過恢復(fù)花生四烯酸代謝平衡，減輕肺上皮細(xì)胞這一COPD主要損傷部位的COPD相關(guān)鐵死亡。研究將清肺通絡(luò)方及其關(guān)鍵成分定位為具有疾病修飾潛力的候選干預(yù)方案，為COPD治療中尚未滿足的臨床需求提供了新的研究依據(jù)。

01

研究背景及科學(xué)問題

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種進(jìn)行性肺部疾病，主要特征是持續(xù)性氣流受限和呼吸道癥狀。全球范圍內(nèi)，COPD相關(guān)致殘率和死亡率仍在上升；隨著人口老齡化，其患病率預(yù)計還將進(jìn)一步增加，公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)也會持續(xù)加重。COPD的主要病因是長期暴露于有害氣體和顆粒物，尤其是香煙煙霧（CS）。香煙煙霧可驅(qū)動持續(xù)炎癥、肺泡損傷，即肺氣腫，以及小氣道阻塞性改變，如黏液栓形成，最終導(dǎo)致不可逆氣流受限、氣道阻力升高和肺功能受損。極端溫度、聚氯乙烯產(chǎn)品釋放的鄰苯二甲酸酯等環(huán)境因素，也被認(rèn)為會加重癥狀并推動疾病進(jìn)展。COPD病因復(fù)雜，臨床異質(zhì)性明顯，使廣泛有效治療方案的開發(fā)面臨挑戰(zhàn)。目前臨床管理主要依賴長效支氣管擴(kuò)張劑（LABAs/LAMAs）和吸入性糖皮質(zhì)激素（ICSs），這些治療可緩解癥狀，但難以阻止疾病進(jìn)展或逆轉(zhuǎn)基礎(chǔ)組織損傷。因此，亟需開發(fā)能夠靶向COPD核心分子機(jī)制的新型治療策略。

在COPD的關(guān)鍵驅(qū)動因素中，慢性炎癥和氧化應(yīng)激被認(rèn)為是核心病理機(jī)制。長期暴露于香煙煙霧或其他環(huán)境污染物會破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，引起細(xì)胞功能障礙，并促進(jìn)C反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎介質(zhì)釋放，從而造成嚴(yán)重氣道損傷。這一炎癥級聯(lián)反應(yīng)會同時誘發(fā)持續(xù)性氧化應(yīng)激，形成活性氧積累和抗氧化能力耗竭的惡性循環(huán)。持續(xù)炎癥和過量ROS還會損害線粒體功能，導(dǎo)致線粒體ROS過度產(chǎn)生、線粒體DNA損傷和突變。這不僅放大氧化應(yīng)激，還會擾亂線粒體自噬和線粒體動力學(xué)，最終削弱線粒體質(zhì)量控制，影響受損線粒體清除。線粒體功能進(jìn)一步惡化后，又會持續(xù)激活炎癥反應(yīng)，推動COPD進(jìn)展。

與此同時，氧化應(yīng)激會加重細(xì)胞損傷，并可誘導(dǎo)鐵死亡。鐵死亡是一種鐵依賴性、由脂質(zhì)過氧化驅(qū)動的程序性細(xì)胞死亡，其特征包括鐵蛋白重鏈（FTH）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）等關(guān)鍵標(biāo)志物失衡，鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物（LPOs）積累，以及高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）釋放。越來越多研究提示，鐵死亡參與COPD發(fā)生發(fā)展，并將鐵穩(wěn)態(tài)紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)與細(xì)胞功能持續(xù)受損聯(lián)系起來。炎癥、氧化應(yīng)激和鐵死亡之間存在復(fù)雜交互，因此，同時靶向多個相互關(guān)聯(lián)通路的干預(yù)策略，可能比單一靶點治療具有更好的效果。

花生四烯酸（AA）代謝失衡與COPD發(fā)病密切相關(guān)，并可導(dǎo)致炎癥、脂質(zhì)過氧化和鐵死亡。在AA代謝通路中，AA可經(jīng)環(huán)氧合酶（COX）、脂氧合酶（LOX）和細(xì)胞色素P450（CYP）等多條酶促途徑代謝，生成多種類二十烷酸。近期研究進(jìn)一步闡明了該通路中關(guān)鍵酶的作用。除經(jīng)典促炎功能外，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2/COX-2）已被認(rèn)為是鐵死亡的重要調(diào)控因子，可通過PTGS2-PGE2、NF-κB-PTGS2和PTGS2-AKR1C3-GPX4等信號軸促進(jìn)脂質(zhì)過氧化。12/15-LOX也被報道為脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的重要調(diào)控因子。值得注意的是，經(jīng)CYP介導(dǎo)AA代謝產(chǎn)生的環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs）具有抗炎和抗氧化作用，例如通過CYP2J2生成；但EETs可被可溶性環(huán)氧化物水解酶（EPHX2/sEH）迅速代謝為相應(yīng)的二羥基二十碳三烯酸（DHETs），而DHETs具有促炎和促氧化作用，可能進(jìn)一步加重脂質(zhì)過氧化并促進(jìn)鐵死亡信號。PTGS2、12/15-LOX、CYP2J2和EPHX2等關(guān)鍵酶因此被認(rèn)為是COPD潛在治療靶點。

然而，目前COPD植物藥研究主要集中于PTGS2與12/15-LOX的雙重抑制，例如補(bǔ)肺活血膠囊和桑葉提取物的相關(guān)研究。相比之下，同時靶向PTGS2和EPHX2的植物藥研究仍較為空白。合成雙重抑制劑PTUPB可同時靶向PTGS2和EPHX2，并已在肺部疾病中顯示出一定潛力。例如，PTUPB可抑制巨噬細(xì)胞激活并下調(diào)炎癥相關(guān)基因，從而減輕急性肺損傷和COPD進(jìn)展。此外，PTGS2和EPHX2雙重抑制還可顯著降低博來霉素誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中衰老相關(guān)分子表達(dá)。盡管如此，單一合成化合物的副作用風(fēng)險和潛在藥代動力學(xué)局限不容忽視。同時，這種雙靶點抑制策略是否能在肺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生類似保護(hù)作用，仍有待明確；而肺上皮細(xì)胞正是COPD損傷的主要發(fā)生部位。

傳統(tǒng)中藥（TCM）具有多成分、多靶點特點，為COPD等復(fù)雜呼吸系統(tǒng)疾病提供了有潛力的治療思路。清肺通絡(luò)方（QFTLF）源自麻杏石甘湯，后者是治療呼吸道感染的經(jīng)典方劑。近年來，清肺通絡(luò)方因其在呼吸系統(tǒng)疾病中的療效而被用于COPD治療。臨床研究顯示，清肺通絡(luò)方可顯著緩解SARS-CoV-2感染患者的咳嗽、咳痰等癥狀，緩解率約為89%。這些結(jié)果提示清肺通絡(luò)方可能具有治療COPD的潛力。不過，清肺通絡(luò)方發(fā)揮抗COPD作用的多靶點機(jī)制和活性物質(zhì)基礎(chǔ)，尤其是其是否調(diào)控PTGS2和EPHX2，仍未得到系統(tǒng)闡明，這限制了對其治療潛力的深入理解。

近年來，多組學(xué)方法為系統(tǒng)整合宏觀和微觀機(jī)制提供了有力工具，也為闡明中藥活性成分和作用機(jī)制提供了重要路徑。但多組學(xué)數(shù)據(jù)來自不同生物分析平臺，具有分布不統(tǒng)一、質(zhì)量差異大、動態(tài)范圍不同等特點；不同組學(xué)平臺還存在各自技術(shù)偏倚，并需要特定數(shù)據(jù)處理方法。因此，基因、轉(zhuǎn)錄本和蛋白在不同數(shù)據(jù)集之間的直接比較并不容易。多模態(tài)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析可從不同維度提供互補(bǔ)生物學(xué)信息，從而更準(zhǔn)確地排序關(guān)鍵基因和通路。計算機(jī)輔助藥物設(shè)計（CADD）包括誘導(dǎo)契合分子對接、分子動力學(xué)模擬、結(jié)合自由能和結(jié)合模式分析，結(jié)合SPR驗證，可有效評估小分子與受體相互作用的穩(wěn)定性、親和力和結(jié)合方式。這種整合策略有助于篩選主要活性成分，也為解析中藥干預(yù)靶點的物質(zhì)基礎(chǔ)和發(fā)現(xiàn)疾病治療候選化合物提供了可靠方法。

因此，為闡明清肺通絡(luò)方的分子機(jī)制和活性成分，尤其是其對PTGS2/EPHX2的雙重調(diào)控作用，并探究這種雙靶點抑制策略在緩解COPD相關(guān)炎癥和鐵死亡方面是否優(yōu)于單靶點干預(yù)，研究采用了整合方法，包括基于UPLC-MS/MS的血清藥物化學(xué)、多模態(tài)數(shù)據(jù)整合分析、CADD、SPR以及體內(nèi)外實驗驗證。研究結(jié)果表明，PTGS2/EPHX2雙重抑制可在COPD肺上皮細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用。清肺通絡(luò)方是一種新的天然來源PTGS2/EPHX2雙重抑制劑，具有多成分、多靶點優(yōu)勢，可通過恢復(fù)花生四烯酸代謝平衡，減輕COPD相關(guān)鐵死亡、炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化。研究還發(fā)現(xiàn)，7個入血成分構(gòu)成該作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其中Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside顯示出作為PTGS2/EPHX2雙重抑制劑的潛力。整體而言，這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)同時靶向PTGS2/EPHX2的植物藥或藥物組合提供了策略基礎(chǔ)，也為清肺通絡(luò)方在COPD中的臨床應(yīng)用提供了機(jī)制支持。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

清肺通絡(luò)方的化學(xué)成分特征與質(zhì)量控制

研究首先采用正、負(fù)離子模式下的UPLC-MS/MS系統(tǒng)表征清肺通絡(luò)方提取物的化學(xué)組成?；诰_質(zhì)量數(shù)、MS/MS碎片模式以及與MWDB數(shù)據(jù)庫的保留時間匹配，研究共初步鑒定出442個化合物，其中正離子模式下檢測到277個，負(fù)離子模式下檢測到165個。這些成分主要包括172個黃酮類、88個生物堿、64個酚酸類、36個醌類、17個木脂素和香豆素類、8個萜類、2個鞣質(zhì)類以及55個其他化合物。這些結(jié)果為后續(xù)藥效和機(jī)制研究提供了植物化學(xué)基礎(chǔ)。

為保證清肺通絡(luò)方研究的重復(fù)性和質(zhì)量控制，作者選擇liquiritin、rhamnocitrin、chlorogenic acid、4-hydroxybenzoic acid和vanillin作為5個代表性定量標(biāo)志物。選擇依據(jù)包括：這些成分在提取物中豐度較高且檢測穩(wěn)定；與COPD相關(guān)炎癥和氧化應(yīng)激具有藥理學(xué)相關(guān)性；已報道存在于清肺通絡(luò)方組成藥材中；并且有標(biāo)準(zhǔn)品可用于可靠定量。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫，這5個標(biāo)志物分別關(guān)聯(lián)方中不同藥材來源，并覆蓋11味組成藥材中的6味，同時來自傳統(tǒng)“君臣佐使”配伍結(jié)構(gòu)中的不同角色。方法學(xué)驗證顯示，5個標(biāo)志物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，日內(nèi)和日間精密度均低于10% RSD，回收率為93.51%至119.45%，符合接受標(biāo)準(zhǔn)。定量分析顯示，liquiritin、rhamnocitrin、chlorogenic acid、4-hydroxybenzoic acid和vanillin在清肺通絡(luò)方中的平均濃度分別為6.939、0.132、2.009、208.000和5.390 μmol/L。

圖1：基于UPLC-MS/MS對清肺通絡(luò)方（QFTLF）進(jìn)行化學(xué)表征。A、B分別為清肺通絡(luò)方提取物在正離子（A）和負(fù)離子（B）模式下獲得的代表性總離子流色譜圖（TIC）。圖中標(biāo)注了5個代表性定量標(biāo)志物，包括liquiritin、rhamnocitrin、chlorogenic acid、4-hydroxybenzoic acid和vanillin，同時標(biāo)出了它們的保留時間及相應(yīng)藥材來源。

清肺通絡(luò)方改善COPD大鼠的肺功能、病理損傷和系統(tǒng)性炎癥

為系統(tǒng)評價清肺通絡(luò)方對LPS聯(lián)合香煙煙霧誘導(dǎo)COPD大鼠的治療作用，研究對大鼠連續(xù)灌胃不同劑量清肺通絡(luò)方28天，并以氨茶堿（AML）作為經(jīng)典陽性對照。評價內(nèi)容包括體重、肺組織外觀、呼吸功能、組織病理學(xué)、促炎細(xì)胞因子水平和凝血指標(biāo)。

體重監(jiān)測顯示，香煙煙霧暴露使大鼠體重增長減慢，而清肺通絡(luò)方干預(yù)可改善這一變化。肺組織外觀觀察顯示，與模型組相比，清肺通絡(luò)方能夠改善LPS和香煙煙霧暴露導(dǎo)致的肺體積增大以及肺表面暗紅改變。組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步顯示，模型組出現(xiàn)嚴(yán)重肺泡隔斷裂、支氣管平滑肌增厚、支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤、膠原沉積、血管平滑肌增生、杯狀細(xì)胞化生和黏蛋白分泌增加等病理改變；清肺通絡(luò)方處理后，上述病變明顯減輕。肺功能檢測顯示，模型組EF50、PEF、EV、TV、AV和PIF下降，同時呼吸頻率F升高；清肺通絡(luò)方可在不同程度上緩解這些功能損傷。系統(tǒng)性炎癥方面，清肺通絡(luò)方顯著降低大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎細(xì)胞因子水平。支氣管肺泡灌洗液（BALF）總細(xì)胞計數(shù)顯示，模型組細(xì)胞數(shù)明顯升高，而清肺通絡(luò)方可降低這一變化。凝血指標(biāo)檢測顯示，清肺通絡(luò)方顯著降低升高的纖維蛋白原（Fib），并逆轉(zhuǎn)香煙煙霧暴露導(dǎo)致的凝血酶原時間（PT）和活化部分凝血活酶時間（APTT）縮短?？傮w而言，清肺通絡(luò)方通過改善呼吸功能、減輕肺泡、支氣管和血管病理損傷，并降低系統(tǒng)性炎癥，表現(xiàn)出較全面的抗COPD作用。

圖2：清肺通絡(luò)方減輕脂多糖（LPS）和香煙煙霧（CS）誘導(dǎo)的COPD相關(guān)大鼠病理改變。A，COPD大鼠模型建立及給藥流程。B，實驗期間大鼠體重變化（n = 6）。C，各組大鼠代表性肺組織形態(tài)圖像（n = 6）。D，肺組織HE染色、Masson染色和AB-PAS染色代表性圖像。E，呼吸功能評價（n = 6）。F，大鼠血清促炎細(xì)胞因子檢測（n = 6）。G，大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）總細(xì)胞計數(shù)（n = 4）。H，大鼠血漿凝血指標(biāo)檢測（n = 3）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，與COPD模型組（MOD）相比。

清肺通絡(luò)方原型入血成分的鑒定與靶點預(yù)測

作為一個高度復(fù)雜的中藥復(fù)方，明確哪些成分能夠進(jìn)入血清，是研究清肺通絡(luò)方抗COPD機(jī)制的關(guān)鍵。研究采用UPLC-MS/MS比較清肺通絡(luò)方提取物、空白血清和清肺通絡(luò)方含藥血清在正、負(fù)離子模式下的TIC圖譜。前文已在清肺通絡(luò)方提取物中鑒定出442個化合物；在清肺通絡(luò)方含藥血清中，共檢測到414個化合物，包括63個酚酸類、147個黃酮類、34個醌類、14個木脂素和香豆素類、89個生物堿、8個萜類、2個鞣質(zhì)類和57個其他成分。進(jìn)一步分析顯示，血清中檢測到60個成分，其中58個被鑒定為原型入血成分，包括5個酚酸類、36個黃酮類、3個醌類、1個木脂素/香豆素類、4個生物堿、1個萜類和8個其他成分。隨后，研究利用SwissTargetPrediction預(yù)測這58個原型成分的潛在靶點，最終獲得123個潛在靶點，并進(jìn)一步構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

圖3：清肺通絡(luò)方原型入血成分的鑒定。A，清肺通絡(luò)方提取物、空白血清和清肺通絡(luò)方含藥血清（QFTLF serum）在正離子（P）和負(fù)離子（N）模式下的疊加TIC圖譜。B，清肺通絡(luò)方提取物與清肺通絡(luò)方含藥血清中化合物類別的比較分析。C，清肺通絡(luò)方原型入血成分的鑒定及分類圖。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)揭示清肺通絡(luò)方抗COPD的潛在調(diào)控機(jī)制

為進(jìn)一步探索清肺通絡(luò)方治療COPD的潛在機(jī)制，研究開展了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析。轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，研究將FC > 1.5或 < 1/1.5且p < 0.05的基因定義為差異表達(dá)基因（DEGs）。結(jié)果顯示，在MOD與CON比較中，發(fā)現(xiàn)256個上調(diào)DEGs和180個下調(diào)DEGs；在QFTLF與MOD比較中，發(fā)現(xiàn)25個上調(diào)DEGs和135個下調(diào)DEGs。其中，共有63個DEGs在QFTLF vs. MOD vs. CON比較中呈現(xiàn)“V”形或“Λ”形表達(dá)趨勢。對這些趨勢顯著DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)，相關(guān)生物過程主要涉及免疫反應(yīng)、補(bǔ)體激活、免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)等；細(xì)胞組分主要涉及免疫球蛋白復(fù)合物、細(xì)胞外空間和細(xì)胞表面；分子功能主要涉及抗原結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性和蛋白酶結(jié)合。KEGG分析識別出5條潛在調(diào)控通路，包括補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、金黃色葡萄球菌感染以及炎癥介質(zhì)調(diào)控TRP通道。

蛋白質(zhì)組學(xué)中，研究將FC > 1.2或 < 1/1.2且p < 0.05的蛋白定義為差異表達(dá)蛋白（DEPs）。結(jié)果顯示，MOD與CON比較中發(fā)現(xiàn)183個上調(diào)DEPs和636個下調(diào)DEPs；QFTLF與MOD比較中發(fā)現(xiàn)438個上調(diào)DEPs和136個下調(diào)DEPs。其中，共有197個DEPs在QFTLF vs. MOD vs. CON比較中呈現(xiàn)“V”形或“Λ”形表達(dá)趨勢。GO分析提示，這些DEPs相關(guān)的關(guān)鍵生物過程包括蛋白質(zhì)靶向和鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞黏附負(fù)調(diào)控；關(guān)鍵細(xì)胞組分包括細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠和軸絲微管；關(guān)鍵分子功能包括蛋白結(jié)合、蛋白同源二聚化活性和SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合。KEGG分析識別出20條潛在調(diào)控通路，包括糖尿病性心肌病、NOD樣受體信號通路、多種神經(jīng)退行性疾病通路、氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)（TCA cycle）。整體來看，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果提示，清肺通絡(luò)方主要通過調(diào)控炎癥、免疫反應(yīng)和代謝等關(guān)鍵生物學(xué)功能，以及25條潛在通路來緩解COPD。

圖4：轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示清肺通絡(luò)方抗COPD的潛在機(jī)制。A，轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異表達(dá)基因（DEGs）火山圖（FC > 1.5或 < 1/1.5，p < 0.05）。B，識別在CON、MOD和QFTLF組之間呈“V”形（藍(lán)色）或“Λ”形（粉色）表達(dá)趨勢的DEGs。C，B中趨勢顯著DEGs的聚類熱圖。D、E，趨勢顯著DEGs的GO和KEGG通路富集分析（p < 0.05）。F，蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)蛋白（DEPs）火山圖（FC > 1.2或 < 1/1.2，p < 0.05）。G，識別三組之間呈“V”形（藍(lán)色）或“Λ”形（粉色）表達(dá)趨勢的DEPs。H，G中趨勢顯著DEPs的聚類熱圖。I、J，趨勢顯著DEPs的GO和KEGG通路富集分析（p < 0.05）。

多模態(tài)數(shù)據(jù)整合鎖定清肺通絡(luò)方原型入血成分調(diào)控的核心通路和靶點

轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，清肺通絡(luò)方治療COPD的潛在調(diào)控功能具有較高一致性。為進(jìn)一步明確原型入血成分調(diào)控的核心機(jī)制、靶點和細(xì)胞類型，研究進(jìn)行了多模態(tài)數(shù)據(jù)分析。

首先，研究對各比較組中的DEGs和DEPs進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，以評估轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組表達(dá)趨勢的一致性。結(jié)果顯示，兩類數(shù)據(jù)整體相關(guān)性較強(qiáng)。在MOD vs. CON組的357,956個基因-蛋白對中，32.17%呈正相關(guān)，37.32%呈負(fù)相關(guān)；在QFTLF vs. MOD組的92,879個基因-蛋白對中，21.93%呈正相關(guān)，48.19%呈負(fù)相關(guān)。這為后續(xù)整合分析提供了可靠基礎(chǔ)。隨后，研究通過Venn分析整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)識別的5條潛在調(diào)控通路中的基因、蛋白質(zhì)組學(xué)識別的20條潛在調(diào)控通路中的基因，以及原型入血成分相關(guān)靶基因，篩選出4個潛在關(guān)鍵靶點：PTGS2、EPHX2、PRKCG和ADCY2。

進(jìn)一步地，研究將這4個潛在關(guān)鍵靶點與上述25條潛在通路整合分析，將受超過2個潛在關(guān)鍵靶點調(diào)控的通路定義為原型入血成分調(diào)控的關(guān)鍵通路。結(jié)果共識別出4條潛在關(guān)鍵通路，包括花生四烯酸代謝、炎癥介質(zhì)調(diào)控TRP通道、糖尿病性心肌病以及多種神經(jīng)退行性疾病通路。隨后，研究利用PS-V2N算法構(gòu)建由4條關(guān)鍵通路和58個成分組成的復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行基因優(yōu)先級排序。鑒于花生四烯酸代謝失衡與COPD發(fā)病密切相關(guān)，且調(diào)節(jié)該通路可有效緩解香煙煙霧誘導(dǎo)的COPD表型，本研究將花生四烯酸代謝通路作為后續(xù)研究的潛在核心通路。PS-V2N復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析顯示，在清肺通絡(luò)方原型入血成分調(diào)控花生四烯酸代謝通路的前20個靶點中，PTGS2和EPHX2排名前兩位，是該通路中的核心調(diào)控靶點。

GSEA進(jìn)一步顯示，QFTLF組相較MOD組的花生四烯酸代謝通路呈下調(diào)趨勢（NES = ?1.252，F(xiàn)DR q-val = 0.144）。Leading-edge子集分析顯示，PTGS2和EPHX2在負(fù)向端核心富集，是該通路受到抑制的主要驅(qū)動因子；而CYP2J4在正向端核心富集并顯著上調(diào)（Log?FC = 0.8528，p < 0.05），提示清肺通絡(luò)方可能同時激活該通路中的保護(hù)性調(diào)控機(jī)制。PPI網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步突出PTGS2、EPHX2和CYP2J4的中心作用，尤其是PTGS2作為核心樞紐節(jié)點。PTGS2、EPHX2和CYP2J4在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組層面呈現(xiàn)一致調(diào)控趨勢：在QFTLF vs. MOD轉(zhuǎn)錄組比較中，PTGS2、EPHX2和CYP2J4的FC分別為0.5381、0.70697和1.8060；在蛋白質(zhì)組層面，相應(yīng)FC分別為0.7568、0.8939和1.706。綜合來看，花生四烯酸代謝是清肺通絡(luò)方原型入血成分調(diào)控的核心通路，PTGS2和EPHX2是核心靶點，CYP2J4可能參與該通路中的保護(hù)性調(diào)控。

圖5：多模態(tài)數(shù)據(jù)整合揭示清肺通絡(luò)方原型入血成分相關(guān)的核心通路和靶點。A，不同比較組中DEGs和DEPs的Spearman相關(guān)分析（|r|≥0.7表示強(qiáng)相關(guān)）。B，Venn圖顯示原型入血成分調(diào)控的關(guān)鍵靶點，該分析整合了調(diào)控通路基因和成分相關(guān)基因。C，基于關(guān)鍵靶基因顯示原型入血成分調(diào)控關(guān)鍵通路的柱狀圖。D，基于頂點到網(wǎng)絡(luò)鄰近評分（PS-V2N）的復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)來源于原型入血成分和關(guān)鍵通路。E，PS-V2N對花生四烯酸代謝通路相關(guān)基因進(jìn)行優(yōu)先級排序。F，QFTLF vs. MOD組中花生四烯酸代謝通路的基因集富集分析（GSEA），并展示核心富集基因熱圖和PPI網(wǎng)絡(luò)分析。G，假設(shè)示意圖，展示CS和QFTLF對花生四烯酸代謝通路的調(diào)控。

單細(xì)胞RNA測序驗證核心通路和靶點，并識別關(guān)鍵細(xì)胞類型

為驗證上述核心機(jī)制并確定其在人體COPD中的細(xì)胞定位，研究分析了兩個公開單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集。首先，研究分析了來源于6例COPD患者肺組織的GSE269390數(shù)據(jù)集。經(jīng)Seurat進(jìn)行降維和細(xì)胞聚類后，識別出8類主要細(xì)胞。ScMetabolism代謝分析顯示，不同細(xì)胞群具有不同代謝特征，其中花生四烯酸代謝在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AT2 cells）中顯著富集。鑒于花生四烯酸代謝與鐵死亡密切相關(guān)，研究進(jìn)一步考察了PTGS2、EPHX2、CYP2J2和GPX4等關(guān)鍵基因的細(xì)胞分布。其中，CYP2J2是小鼠Cyp2j4的人同源基因，后文統(tǒng)一稱為CYP2J2。結(jié)果顯示，這些基因主要表達(dá)于上皮細(xì)胞類型，尤其是AT2細(xì)胞和纖毛細(xì)胞，提示核心通路和靶點的定位可能集中于AT2細(xì)胞。沿AT2細(xì)胞擬時序軌跡分析顯示，核心基因在AT2細(xì)胞分化過程中保持相對穩(wěn)定。細(xì)胞通訊分析進(jìn)一步提示，AT2細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的通訊對花生四烯酸代謝具有重要意義。

為進(jìn)一步評估COPD與健康個體AT2細(xì)胞中花生四烯酸代謝及相關(guān)基因是否存在差異，研究分析了另一個scRNA-seq數(shù)據(jù)集GSE222374，該數(shù)據(jù)集包括6例COPD患者和4名健康對照的EPCAM陽性活上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，共包含81,896個細(xì)胞，分為9類主要細(xì)胞類型，其中AT2細(xì)胞為78,699個。氣泡圖顯示，COPD AT2細(xì)胞中花生四烯酸代謝顯著上調(diào)。GSVA評分進(jìn)一步證實，與健康A(chǔ)T2細(xì)胞相比，COPD AT2細(xì)胞中該通路顯著升高（p < 2.22e-16）。在基因?qū)用妫琍TGS2和EPHX2在COPD AT2細(xì)胞中顯著上調(diào)，而CYP2J2和GPX4顯著下調(diào)（p < 0.0001）。這些發(fā)現(xiàn)與COPD大鼠中觀察到的通路和靶基因改變一致。

圖6：單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）分析驗證人體COPD中的核心通路和靶點，并識別關(guān)鍵細(xì)胞類型。A，均勻流形近似與投影（UMAP）可視化圖，顯示COPD患者肺組織中識別出的8類主要細(xì)胞。B，基于scMetabolism分析的氣泡圖，顯示不同細(xì)胞類型中前30個代謝通路的活性。C，小提琴圖顯示PTGS2、EPHX2、CYP2J2和GPX4在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)水平。D，肺上皮scRNA-seq數(shù)據(jù)集中細(xì)胞分布的UMAP可視化圖。E，不同組別和上皮細(xì)胞類型中花生四烯酸代謝基因集的基因集變異分析（GSVA）富集評分。F，小提琴圖比較健康組與COPD組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AT2）中花生四烯酸代謝通路評分。G，小提琴圖顯示健康組與COPD組AT2細(xì)胞中PTGS2、EPHX2、CYP2J2和GPX4的差異表達(dá)水平。

體內(nèi)驗證清肺通絡(luò)方對花生四烯酸代謝相關(guān)機(jī)制的調(diào)控

在多模態(tài)數(shù)據(jù)整合基礎(chǔ)上，研究進(jìn)一步通過體內(nèi)實驗驗證花生四烯酸代謝相關(guān)核心機(jī)制。首先，作者采用PERLS-DAB染色觀察清肺通絡(luò)方對COPD大鼠肺組織鐵沉積的影響。結(jié)果顯示，與CON組相比，MOD組肺組織鐵沉積顯著增加（p < 0.01）；清肺通絡(luò)方處理可不同程度減少鐵沉積（p < 0.01），這一結(jié)果與Fe2?定量檢測結(jié)果一致。

隨后，研究評估清肺通絡(luò)方對大鼠肺組織脂質(zhì)過氧化的影響。生化試劑盒結(jié)果顯示，清肺通絡(luò)方顯著提高COPD大鼠肺組織中T-SOD和GSH水平（p < 0.01），同時降低MDA水平（p < 0.01）。研究還檢測了14,15-EET、14,15-DHET、11,12-EET和11,12-DHET等花生四烯酸代謝物。結(jié)果顯示，香煙煙霧暴露后，清肺通絡(luò)方干預(yù)顯著升高肺組織中11,12-EET水平（p < 0.05），并降低11,12-DHET水平（p < 0.01）；但14,15-EET和14,15-DHET在CS暴露或清肺通絡(luò)方干預(yù)后均未發(fā)生顯著變化。這提示清肺通絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝，減少CS暴露后大鼠肺組織脂質(zhì)過氧化及后續(xù)鐵死亡。

為在組織水平驗證關(guān)鍵靶基因表達(dá)，研究對大鼠肺組織中PTGS2和EPHX2進(jìn)行免疫熒光分析，并與ProSPC，即Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物pro-surfactant protein C，共定位。結(jié)果顯示，與CON組相比，MOD組肺組織PTGS2和EPHX2表達(dá)均顯著升高；清肺通絡(luò)方干預(yù)后，這一升高明顯減弱。共定位分析證實，上調(diào)的PTGS2和EPHX2主要表達(dá)于ProSPC陽性AT2細(xì)胞。WB分析進(jìn)一步驗證了清肺通絡(luò)方對PTGS2和EPHX2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步明確清肺通絡(luò)方調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化是否與抑制PTGS2-PPARγ-CYP2J2和EPHX2介導(dǎo)通路有關(guān)，研究繼續(xù)進(jìn)行WB檢測。結(jié)果顯示，清肺通絡(luò)方顯著降低COPD大鼠肺組織HMGB1和TNFα表達(dá)，同時升高PPARγ、p-PPARγ、CYP2J2和GPX4水平；PTGS2表達(dá)在清肺通絡(luò)方干預(yù)后呈下降趨勢。上述結(jié)果提示，清肺通絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)，減輕COPD肺組織鐵死亡，這一作用與抑制PTGS2-PPARγ-CYP2J2和EPHX2介導(dǎo)通路有關(guān)，而AT2細(xì)胞可能是該過程中的主要調(diào)控細(xì)胞。

圖7：體內(nèi)驗證清肺通絡(luò)方在COPD保護(hù)作用中涉及的花生四烯酸代謝相關(guān)機(jī)制。A，PERLS-DAB染色顯示大鼠肺組織鐵沉積（比例尺 = 20 μm）。B，清肺通絡(luò)方處理后大鼠肺組織Fe2?水平。C，大鼠肺組織脂質(zhì)過氧化相關(guān)指標(biāo)（T-SOD、MDA和GSH）。D，ELISA分析大鼠肺組織中花生四烯酸來源脂質(zhì)代謝物（14,15-EET、14,15-DHET、11,12-EET和11,12-DHET）。E，大鼠肺組織中PTGS2與pro-surfactant protein C（ProSPC，AT2細(xì)胞標(biāo)志物）的免疫熒光染色（ProSPC為紅色，PTGS2為綠色，DAPI為藍(lán)色；比例尺 = 50 μm）。F，大鼠肺組織中EPHX2與ProSPC的免疫熒光染色（ProSPC為紅色，EPHX2為綠色，DAPI為藍(lán)色；比例尺 = 50 μm）。G，大鼠肺組織中PTGS2和EPHX2熒光強(qiáng)度定量。H，大鼠肺組織中PTGS2、EPHX2及下游通路相關(guān)蛋白的Western blot分析。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，與MOD組相比。生化和免疫熒光分析n = 6；Western blot分析n = 3。

體外確定CSE和清肺通絡(luò)方含藥血清的最佳干預(yù)條件

為進(jìn)一步研究清肺通絡(luò)方對關(guān)鍵機(jī)制的調(diào)控，作者開展了體外實驗。由于體內(nèi)結(jié)果提示AT2細(xì)胞可能是清肺通絡(luò)方的主要調(diào)控細(xì)胞，研究首先采用CCK-8實驗篩選香煙煙霧提取物（CSE）和清肺通絡(luò)方含藥血清作用于AT2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞系MLE-12和A549的最佳劑量和時間。結(jié)果顯示，CSE以劑量和時間依賴方式顯著降低兩種細(xì)胞活力；2.5% CSE處理24 h后，MLE-12和A549細(xì)胞活力降至約70%（p < 0.01），這一條件被廣泛用于誘導(dǎo)上皮細(xì)胞損傷，因此研究選擇2.5% CSE處理24 h用于后續(xù)實驗。

血清篩選顯示，與10% FBS相比，5%、10%、15%和20%清肺通絡(luò)方含藥血清均顯著提高M(jìn)LE-12細(xì)胞活力（p < 0.01），但在A549細(xì)胞中未見顯著保護(hù)作用。由于前期scRNA-seq結(jié)果提示QFTLF靶向的核心通路和基因主要位于AT2細(xì)胞，且MLE-12細(xì)胞對清肺通絡(luò)方含藥血清反應(yīng)更明顯，研究選擇MLE-12細(xì)胞用于后續(xù)機(jī)制驗證。綜合體內(nèi)研究采用的臨床等效劑量，以及體外CCK-8結(jié)果，后續(xù)實驗采用10%清肺通絡(luò)方含藥血清作為干預(yù)濃度。

研究還在BEAS-2B細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中進(jìn)行了類似篩選，以評估不同細(xì)胞類型對CSE和清肺通絡(luò)方含藥血清的反應(yīng)。2.5% CSE處理24 h同樣降低這兩種細(xì)胞活力，但清肺通絡(luò)方含藥血清未表現(xiàn)出明顯保護(hù)作用。隨后，為驗證MLE-12細(xì)胞中CSE誘導(dǎo)損傷與鐵死亡相關(guān)，研究使用鐵死亡抑制劑Fer-1以及鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin和RSL3。結(jié)果顯示，F(xiàn)er-1可改善CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降，而Erastin和RSL3進(jìn)一步加重CSE誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低；同時，CSE導(dǎo)致Fe2?升高和GSH下降，而清肺通絡(luò)方含藥血清可改善這些變化。上述結(jié)果支持后續(xù)以CSE誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞損傷作為體外模型，研究清肺通絡(luò)方對鐵死亡和花生四烯酸代謝的影響。

圖8：確定不同細(xì)胞類型中香煙煙霧提取物（CSE）和清肺通絡(luò)方含藥血清的最佳暴露條件。A–C，采用CCK-8法檢測MLE-12和A549細(xì)胞暴露于CSE和/或清肺通絡(luò)方含藥血清后的細(xì)胞活力。D–F，采用CCK-8法檢測B2B和RAW264.7細(xì)胞暴露于CSE和/或清肺通絡(luò)方含藥血清后的細(xì)胞活力。G，鐵死亡相關(guān)調(diào)節(jié)劑Fer-1、Erastin和RSL3處理24 h后對MLE-12細(xì)胞活力的影響。H，不同藥物處理24 h后對MLE-12細(xì)胞活力的影響。I，不同藥物處理24 h后MLE-12細(xì)胞內(nèi)Fe2?和GSH水平。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n ≥ 3）。A和D中，與CSE 0%組比較；B和E中，與FBS 10%組比較；C和F中，與相應(yīng)CSE處理組比較；G–I中，與對照組（*、**）或CSE組（#、##）比較。*p < 0.05，**p < 0.01； < 0.05，# < 0.01。

清肺通絡(luò)方含藥血清在CSE暴露MLE-12細(xì)胞中調(diào)控花生四烯酸代謝并減輕鐵死亡

在體外機(jī)制驗證中，CSE處理使MLE-12細(xì)胞內(nèi)Fe2?顯著升高，而清肺通絡(luò)方含藥血清可降低這一積累。脂質(zhì)過氧化相關(guān)指標(biāo)檢測顯示，CSE誘導(dǎo)MDA升高，同時降低T-SOD和GSH；清肺通絡(luò)方含藥血清能夠逆轉(zhuǎn)這些改變。BODIPY 581/591 C11染色和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實，CSE顯著提高細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，而清肺通絡(luò)方含藥血清可降低脂質(zhì)過氧化程度。

ELISA檢測花生四烯酸代謝物顯示，CSE處理后，MLE-12細(xì)胞中11,12-EET下降、11,12-DHET升高，提示保護(hù)性EETs與有害DHETs之間的平衡被破壞；清肺通絡(luò)方含藥血清則提高11,12-EET并降低11,12-DHET，從而部分恢復(fù)花生四烯酸代謝平衡。免疫熒光顯示，CSE可誘導(dǎo)PTGS2和EPHX2表達(dá)增強(qiáng)，而清肺通絡(luò)方含藥血清可降低其表達(dá)。Western blot進(jìn)一步顯示，清肺通絡(luò)方含藥血清可調(diào)節(jié)PTGS2、EPHX2及下游通路相關(guān)蛋白，提示其體外作用與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一致。

圖9：體外驗證清肺通絡(luò)方含藥血清在CSE暴露MLE-12細(xì)胞中對花生四烯酸代謝的調(diào)控作用。除特別說明外，所有檢測均在清肺通絡(luò)方含藥血清處理24 h后進(jìn)行。A，細(xì)胞內(nèi)Fe2?水平（n = 6）。B，脂質(zhì)過氧化相關(guān)指標(biāo)（MDA、T-SOD和GSH）（n = 6）。C，BODIPY 581/591 C11染色顯示MLE-12細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的代表性共聚焦圖像，比例尺 = 50 μm（n = 6）。D，基于BODIPY 581/591 C11染色，通過流式細(xì)胞術(shù)定量脂質(zhì)過氧化（n = 3）。E，ELISA分析花生四烯酸代謝物（14,15-EET、14,15-DHET、11,12-EET和11,12-DHET）（n = 6）。F，MLE-12細(xì)胞中PTGS2表達(dá)（紅色）的共聚焦免疫熒光圖像；細(xì)胞核采用DAPI染色（藍(lán)色），比例尺 = 50 μm。G，MLE-12細(xì)胞中EPHX2表達(dá)（紅色）的共聚焦免疫熒光圖像；細(xì)胞核采用DAPI染色（藍(lán)色），比例尺 = 50 μm。H，PTGS2、EPHX2及下游通路相關(guān)蛋白的Western blot分析（n = 3）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，與CSE（2.5%）組相比。

PTGS2和EPHX2抑制劑模擬清肺通絡(luò)方的保護(hù)效應(yīng)

為進(jìn)一步判斷清肺通絡(luò)方的保護(hù)作用是否依賴PTGS2和EPHX2抑制，研究采用PTGS2選擇性抑制劑Celecoxib和EPHX2選擇性抑制劑GSK2256294A作為藥理學(xué)對照。MLE-12細(xì)胞在2.5% CSE存在條件下，分別聯(lián)合10%清肺通絡(luò)方含藥血清、Celecoxib（25 μM）或GSK2256294A（25 μM）處理。結(jié)果顯示，清肺通絡(luò)方含藥血清、Celecoxib和GSK2256294A均顯著減輕CSE誘導(dǎo)的Fe2?積累（p < 0.01）。脂質(zhì)過氧化檢測也顯示，三種處理均可顯著抵消CSE誘導(dǎo)的MDA升高，以及GSH和T-SOD活性下降（p < 0.01）。Western blot進(jìn)一步證實，清肺通絡(luò)方含藥血清、Celecoxib和GSK2256294A均可降低CSE誘導(dǎo)升高的促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α蛋白水平，并恢復(fù)抗鐵死亡蛋白GPX4表達(dá)。

這些結(jié)果說明，分別藥理性抑制PTGS2或EPHX2，均可重復(fù)清肺通絡(luò)方抵抗CSE誘導(dǎo)鐵死亡、脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)的核心保護(hù)效應(yīng)，從而支持清肺通絡(luò)方通過PTGS2和EPHX2雙重抑制發(fā)揮作用的中心假設(shè)。并且，在調(diào)控脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)方面，清肺通絡(luò)方的雙靶點抑制作用似乎優(yōu)于單一靶點抑制。

圖10：清肺通絡(luò)方含藥血清及PTGS2/EPHX2抑制劑對CSE暴露MLE-12細(xì)胞中鐵死亡、脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)的影響。A，在2.5% CSE存在條件下，清肺通絡(luò)方含藥血清、Celecoxib（25 μM）或GSK2256294A（25 μM）處理24 h后，MLE-12細(xì)胞內(nèi)Fe2?水平（n = 6）。B，處理24 h后MLE-12細(xì)胞脂質(zhì)過氧化相關(guān)指標(biāo)（MDA、T-SOD和GSH）（n = 6）。C，處理24 h后MLE-12細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α）和抗鐵死亡蛋白GPX4的Western blot分析（n = 3）。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，與CSE（2.5%）組相比。

計算篩選并驗證靶向PTGS2/EPHX2的關(guān)鍵活性成分

鑒于清肺通絡(luò)方原型入血成分復(fù)雜，研究采用誘導(dǎo)契合分子對接（IFD）探索清肺通絡(luò)方作用于PTGS2和EPHX2的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究將對接評分≤?5 kcal/mol的化合物視為潛在活性化合物。基于這一標(biāo)準(zhǔn)，在58個清肺通絡(luò)方原型入血成分中，分別有53個和52個成分顯示出對PTGS2和EPHX2的潛在抑制活性。已知陽性對照藥物的對接評分進(jìn)一步驗證了計算體系對已知特異性相互作用建模的準(zhǔn)確性。值得注意的是，每個靶點排名前20位的對接化合物，其對接評分與相應(yīng)陽性對照相當(dāng)或更優(yōu)，因此被選為候選關(guān)鍵成分。

考慮到這些化合物結(jié)構(gòu)多樣，研究進(jìn)一步基于結(jié)構(gòu)指紋進(jìn)行層次聚類分析，將PTGS2和EPHX2排名前20位的對接化合物分別劃分為5個聚類。綜合考慮各聚類中的化合物數(shù)量、主要藥材來源、《中華人民共和國藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)中的記載、化合物可購買性，以及“君臣佐使”配伍原則，研究最終分別選擇5個潛在關(guān)鍵成分靶向PTGS2和EPHX2。PTGS2相關(guān)關(guān)鍵成分為Narcissoside、Mudanpioside C、Baicalin、Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside；EPHX2相關(guān)關(guān)鍵成分為Hamamelitannin、Choerospondin、Vitexin、Nepitrin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside。

為評估結(jié)合穩(wěn)定性，研究對PTGS2和EPHX2復(fù)合體系進(jìn)行了100 ns分子動力學(xué)模擬。RMSD結(jié)果顯示，PTGS2與Narcissoside、Baicalin、Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside形成的復(fù)合體系在100 ns模擬中波動保持在一定范圍內(nèi)；Mudanpioside C-PTGS2復(fù)合體系在30 ns前有一定波動，但30 ns后至模擬結(jié)束保持穩(wěn)定。RMSF結(jié)果也顯示，不同復(fù)合體系中蛋白整體波動趨勢趨于穩(wěn)定。EPHX2與Hamamelitannin、Choerospondin、Vitexin、Nepitrin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside形成的復(fù)合物同樣表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性。結(jié)合自由能計算進(jìn)一步支持這些關(guān)鍵成分與PTGS2和EPHX2具有較高結(jié)合親和力，并可形成穩(wěn)定復(fù)合物。

圖11：計算鑒定并驗證靶向PTGS2/EPHX2的關(guān)鍵化合物。A，清肺通絡(luò)方原型入血成分中與PTGS2和EPHX2對接評分最高的前20個化合物。B，與PTGS2對接的前20個原型入血成分的層次聚類分析。C，與EPHX2對接的前20個原型入血成分的層次聚類分析。D，PTGS2-關(guān)鍵化合物復(fù)合物在100 ns模擬過程中的均方根偏差（RMSD）和均方根波動（RMSF）曲線。E，EPHX2-關(guān)鍵化合物復(fù)合物在100 ns模擬過程中的RMSD和RMSF曲線。

SPR實驗驗證關(guān)鍵成分與PTGS2/EPHX2的結(jié)合能力

為實驗驗證關(guān)鍵化合物與PTGS2和EPHX2的結(jié)合特征，研究采用SPR測定其親和力。平衡解離常數(shù)（KD）顯示，對于PTGS2，Baicalin親和力最強(qiáng)（5.69 × 10?? M），其次為Vitexin（6.00 × 10?? M）、Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside（7.49 × 10?? M）、Mudanpioside C（8.24 × 10?? M）和Narcissoside（76.93 × 10?? M）。對于EPHX2，Hamamelitannin（6.58 × 10?? M）和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside（5.75 × 10?? M）親和力最高，其次為Choerospondin（10.71 × 10?? M）、Vitexin（12.70 × 10?? M）和Nepitrin（48.97 × 10?? M）。所有結(jié)合曲線均表現(xiàn)出特異性分子相互作用的典型特征，包括清晰的劑量依賴性響應(yīng)和飽和結(jié)合，說明這些信號更可能來自有限結(jié)合位點介導(dǎo)的特異性結(jié)合，而非非特異性吸附。

研究進(jìn)一步利用PyMOL分析關(guān)鍵活性成分與靶點蛋白結(jié)合腔中的相互作用模式。PTGS2結(jié)合口袋中，不同成分形成了不同氫鍵網(wǎng)絡(luò)：Narcissoside與VAL83、TYR352、ARG480和GLU491形成穩(wěn)定氫鍵；Mudanpioside C主要通過ASP157、ASP482、ILE484和PHE485形成4個氫鍵；Baicalin和Vitexin分別與MET490和TYR353形成關(guān)鍵氫鍵；Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside則與TYR322、TYR352、PHE485和SER497形成氫鍵。EPHX2結(jié)合模式分析顯示，關(guān)鍵殘基在與化合物形成氫鍵中具有保守且特異的作用。ASP104是重要樞紐殘基，可分別與Hamamelitannin、Choerospondin和Vitexin形成穩(wěn)定氫鍵，并與SER184、MET138/GLN153和PHE266配對。ASN128和GLN153參與Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside的氫鍵作用。Nepitrin表現(xiàn)出最廣泛的相互作用網(wǎng)絡(luò)，與ASP104、LEU177、SER181、SER184、LEU186、TYR235、LYN264和PHE266等殘基形成8個氫鍵。

綜合來看，關(guān)鍵成分能夠穩(wěn)定結(jié)合相應(yīng)靶點。對于PTGS2，Mudanpioside C、Baicalin、Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside具有穩(wěn)定結(jié)合證據(jù)，包括較好的SPR來源KD值、典型劑量依賴性傳感圖和特異性氫鍵網(wǎng)絡(luò)。對于EPHX2，Hamamelitannin、Choerospondin、Vitexin、Nepitrin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside也通過一致的生物物理和結(jié)構(gòu)證據(jù)顯示出穩(wěn)定結(jié)合。值得注意的是，Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside表現(xiàn)出作為PTGS2/EPHX2雙重抑制劑的潛力。

圖12：關(guān)鍵靶向PTGS2和EPHX2化合物的實驗驗證與機(jī)制分析。A，表面等離子體共振（SPR）傳感圖，顯示關(guān)鍵化合物與PTGS2蛋白相互作用的代表性結(jié)合曲線、KD值以及結(jié)合/解離速率。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 3），空白傳感芯片上未檢測到顯著結(jié)合響應(yīng)。B，SPR傳感圖，顯示關(guān)鍵化合物與EPHX2蛋白相互作用的代表性結(jié)合曲線、KD值以及結(jié)合/解離速率。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 3），空白傳感芯片上未檢測到顯著結(jié)合響應(yīng)。C，關(guān)鍵化合物與PTGS2復(fù)合物的結(jié)合相互作用模式分析。D，關(guān)鍵化合物與EPHX2復(fù)合物的結(jié)合相互作用模式分析。

關(guān)鍵成分的藥代動力學(xué)性質(zhì)預(yù)測與機(jī)制示意圖總結(jié)

為評估候選化合物的成藥性和初步安全性，研究采用SwissADME和ProTox 3.0預(yù)測這些PTGS2/EPHX2靶向化合物的理化性質(zhì)、藥代動力學(xué)和毒性。毒性預(yù)測顯示，多數(shù)化合物被歸為Class V，而Hamamelitannin和Vitexin被歸為Class IV，提示這些天然化合物整體具有相對有利的初步安全性。藥代動力學(xué)預(yù)測顯示，所有關(guān)鍵化合物的胃腸道吸收均較低，提示其口服生物利用度可能存在限制。其他相關(guān)理化性質(zhì)，包括親脂性、水溶性和成藥性參數(shù)，也在研究中進(jìn)行了總結(jié)。SPR和CADD驗證的穩(wěn)定靶點結(jié)合能力，加上較有利的初步安全性，支持這些成分作為天然抗COPD先導(dǎo)化合物的潛力；但低口服生物利用度也提示，未來可能需要通過制劑和遞送策略進(jìn)行優(yōu)化。

圖13：清肺通絡(luò)方及其靶向PTGS2/EPHX2的活性成分抗COPD作用機(jī)制示意圖。

【Citation】:Wang Y, Tian Y, Bai J, Zhao J, Sun H, Hu G, Yao J, Liu X, Zhang Z, Jin X, Liu Y. Qingfei Tongluo Formula attenuates COPD-associated ferroptosis by restoring arachidonic acid metabolic balance via dual inhibition of prostaglandin-endoperoxide synthase 2 and soluble epoxide hydrolase 2.Phytomedicine.2026;157:158302.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

總體而言，本研究通過整合多模態(tài)數(shù)據(jù)，創(chuàng)新性地證明清肺通絡(luò)方作為一種天然來源的PTGS2和EPHX2雙重抑制劑，可通過恢復(fù)花生四烯酸代謝平衡，減輕肺上皮細(xì)胞中的COPD相關(guān)鐵死亡。這些發(fā)現(xiàn)為系統(tǒng)解析復(fù)雜中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制建立了方法學(xué)框架，同時也為開發(fā)新的雙靶點藥物提供了基礎(chǔ)。最終，研究將清肺通絡(luò)方及其關(guān)鍵成分定位為具有疾病修飾潛力的候選干預(yù)方案，為COPD相關(guān)治療策略提供了有益補(bǔ)充。

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